磷酸鎂骨粘合劑的生物安全性研究.pdf

1、背景：
　　創(chuàng)傷、腫瘤、手術(shù)以及骨折不愈合等原因常常造成骨質(zhì)的缺失，成骨細(xì)胞難以爬過(guò)間隙而不能發(fā)生正常的愈合過(guò)程，最后形成骨不連。人體自身的自體骨具有良好的骨誘導(dǎo)作用，然而受到同種骨和異種骨來(lái)源供應(yīng)的限制。同種異體骨存在傳播疾病的危險(xiǎn)和發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的可能，臨床應(yīng)用受到一定的限制。使用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)骨水泥通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)固定物周?chē)乃少|(zhì)骨達(dá)到強(qiáng)化內(nèi)固定的目的。但是，由于PMM

2、A固化時(shí)放熱，不能被機(jī)體吸收和重塑，阻礙骨折愈合，這些缺點(diǎn)，大大限制了其臨床應(yīng)用的范圍。近年來(lái)，以磷酸鈣為代表的無(wú)機(jī)人工骨替代材料的研發(fā)得到很大發(fā)展。
　　華東理工大學(xué)劉昌勝教授及其合作者在上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(98JC14015)資助下，研制成功了可吸收的新型無(wú)機(jī)骨水泥即磷酸鎂骨水泥(MagnesiumPhosphate Cement，MPC)。通過(guò)成果鑒定(滬科鑒02 G00182)研究水平達(dá)到國(guó)際先進(jìn)，并已獲得專利。專利授權(quán)號(hào)

3、為ZL01105373.9；PTC國(guó)際專利：PTC/CN01/00282。
　　在市科委的資助下(2003年9月至2006年9月，面上項(xiàng)目，編號(hào)為：034119904)，經(jīng)初步研究顯示：MPC粘結(jié)強(qiáng)度明顯大于傳統(tǒng)的磷酸鈣骨水泥，可以對(duì)細(xì)小非負(fù)重區(qū)域的骨折片能直接進(jìn)行粘合；材料同周?chē)琴|(zhì)緊密結(jié)合，界面處未出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞聚集和纖維膜，未引起異物反應(yīng)，無(wú)內(nèi)臟毒性，經(jīng)過(guò)初步實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是滿意的。
　　體內(nèi)植入材料后，該材料及其代

4、謝產(chǎn)物是否對(duì)周?chē)M織細(xì)胞產(chǎn)生影響，是否有遺傳毒性、致癌性和生殖毒性，特別是對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化速度產(chǎn)生影響，以及是否對(duì)周?chē)M織的細(xì)胞產(chǎn)生致突變的作用也有待于進(jìn)一步研究。此外其在活體內(nèi)是否會(huì)激活細(xì)胞炎性因子，引發(fā)免疫反應(yīng)異常，目前還沒(méi)有確切數(shù)據(jù)，這也將是研究的一個(gè)內(nèi)容。
　　目的：
　　磷酸鎂骨粘合劑自研發(fā)以來(lái)，經(jīng)初步研究顯示其粘結(jié)強(qiáng)度明顯大于傳統(tǒng)的磷酸鈣骨水泥，可以對(duì)細(xì)小非負(fù)重區(qū)域的骨折片能直接進(jìn)行粘合；材料同周?chē)琴|(zhì)緊密

5、結(jié)合，界面處未出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞聚集和纖維膜，未引起異物反應(yīng)，無(wú)內(nèi)臟毒性。所以MPC的生物學(xué)特性，經(jīng)過(guò)初步實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是滿意的。但對(duì)于植入新材料，本課題將研究該材料及其代謝產(chǎn)物是否對(duì)周?chē)M織細(xì)胞產(chǎn)生影響，特別是對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化速度產(chǎn)生影響，是否對(duì)周?chē)M織的細(xì)胞產(chǎn)生致突變的作用，在活體內(nèi)是否會(huì)激活細(xì)胞炎性因子，引發(fā)免疫反應(yīng)異常，符合生物安全性的要求，檢測(cè)其生物相容性是否良好。
　　方法：
　　根據(jù)研究目的，本課題分成三個(gè)

6、部分。
　　1遺傳毒性試驗(yàn)：
　　(1)Ames試驗(yàn)：將磷酸鎂骨粘合劑制備浸提液，采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))，取以生理鹽水為陰性對(duì)照，取特定陽(yáng)性物為陽(yáng)性組，在添加大鼠肝臟微粒體酶S9的情況和不添加S9的情況下，測(cè)試各個(gè)組對(duì)各種鼠傷寒沙門(mén)菌(TA100、TA102、TA97 and TA98)的致突變比值(MR)。致突變比值(MR)=實(shí)驗(yàn)組回變菌落數(shù)(Rt)/陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)(Rc)，將突變比值做統(tǒng)計(jì)分

7、析，觀察MPC浸提液對(duì)菌株有無(wú)回復(fù)突變影響。
　　(2)程序外DNA合成試驗(yàn)：取人的外周全血，取不同濃度的MPC浸提液做試驗(yàn)，生理鹽水作為陰性對(duì)照組，硫酸鎳為特定陽(yáng)性組，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入羥基脲和3H-TdR，共同培養(yǎng)后，震蕩，終止反應(yīng)后，收集細(xì)胞，洗滌、固定、脫水；加入閃爍液，計(jì)數(shù)儀上做放射性測(cè)量。測(cè)試結(jié)果用每分鐘放射計(jì)數(shù)(cpm)代表DNA合成。
　　(3)微核試驗(yàn)：取健康成熟昆明雄性小鼠分成三組，不同濃度

8、的MPC浸提液作為試驗(yàn)組，生理鹽水為陰性對(duì)照組，環(huán)磷酰胺為陽(yáng)性組，在小鼠腹腔內(nèi)定期注射，間隔24小時(shí)，分四次給藥法。提取骨髓腔內(nèi)嗜多染紅細(xì)胞(PCG)，涂片、固定、染色、顯微鏡下計(jì)數(shù)微核、計(jì)算出現(xiàn)微核的百分比。
　　2體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)：
　　(1)四唑鹽比色試驗(yàn)：簡(jiǎn)稱MTT試驗(yàn)。取第三代小鼠成骨細(xì)胞(OB)，制成細(xì)胞懸液，不同濃度的MPC浸提液為試驗(yàn)組，普通細(xì)胞培養(yǎng)液為正常對(duì)照組，觀察1天、3天、5天后終止，加入MTT和二甲

9、基亞砜(DMSO)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)，并分級(jí)細(xì)胞毒性。
　　(2)堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試驗(yàn)：取第三代小鼠成骨細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，不同濃度的MPC浸提液為試驗(yàn)組，酚標(biāo)準(zhǔn)液作為標(biāo)準(zhǔn)組，雙蒸水作為空白組，普通的10％DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。培養(yǎng)觀察1、3、5天后終止，用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，計(jì)算酚含量。

10、>　　3細(xì)胞炎性因子表達(dá)測(cè)試試驗(yàn)：
　　取第三代小鼠成骨細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將不同濃度的MPC浸提液作為試驗(yàn)組，細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，用IL-1β、IL-6、TNF-α抗原抗體試劑盒做雙抗體夾心法測(cè)定，觀察1、3、5天后終止，底物液顯色，酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)，繪制曲線圖分析。
　　結(jié)果：
　　1在Ames試驗(yàn)中，TA100、TA102、TA97、TA98菌株陽(yáng)性對(duì)照組回變菌落數(shù)均超過(guò)陰性對(duì)照組2倍以上(MR>2)；

11、MPC浸提液不同濃度劑量組對(duì)菌落平均數(shù)與陰性對(duì)照組的比值均小于2(MR<2)；
　　2 UDS試驗(yàn)中，不同濃度的MPC浸出液的每分鐘放射計(jì)數(shù)(CPM)值有濃度依賴性，隨著浸出液的濃度增加，CPM值也逐步增加；不同濃度MPC浸提液的CPM值均遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照組(不同濃度NiSO4)的CMP值；
　　3微核試驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組微核率比陰性組高10多倍，與MPC浸提液組的微核數(shù)值也相差10倍多；不同濃度的MPC微核率，與陰性對(duì)

12、照組無(wú)顯著差異：不同濃度的微核率不與濃度梯度相應(yīng)，與生理鹽水陰性組接近，不會(huì)引起嗜多染紅細(xì)胞的微核率增加；
　　4 MTT試驗(yàn)中，MPC試驗(yàn)組小鼠成骨細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)在1、3、5天時(shí)分別為87.37％～115.13％、98.96％～118.96％和88.46％～108.92％；細(xì)胞毒性分級(jí)均為0或1級(jí)；不同濃度的MPC浸出液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響；
　　5 ALP檢測(cè)試驗(yàn)，隨著浸提液濃度的提高，ALP值有所下降；不同濃

13、度的MPC浸提液的ALP值與陰性對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異性，不會(huì)影響成骨細(xì)胞正常生長(zhǎng)。
　　6細(xì)胞炎性因子表達(dá)測(cè)定試驗(yàn)，隨著浸提液濃度的提高，炎性因子的表達(dá)沒(méi)有顯著增加；不同濃度的MPC浸提液與陰性對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異性，分子水平不會(huì)促進(jìn)炎性因子的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1磷酸鎂骨粘合劑不會(huì)引起鼠傷寒沙門(mén)菌的回復(fù)突變數(shù)增加，不會(huì)引起基因改變；
　　2磷酸鎂骨粘合劑浸出液對(duì)DNA無(wú)損傷作用；