星斑川鰈(Platichthys stellatus)小電導(dǎo)鈣激活型鉀通道SKCa2基因的克隆及免疫功能研究.pdf

1、鉀離子通道是細(xì)胞膜上一類僅允許鉀離子出入細(xì)胞的跨膜蛋白，通過通道的啟閉控制著離子的跨膜流動，啟動胞內(nèi)各種重要的信息傳導(dǎo)系統(tǒng)，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。SKCa2屬于小電導(dǎo)鈣激活型鉀離子通道(KCa)家族，具有K+選擇性、Ca2+高敏感性和電壓不依賴性等特性，是淋巴細(xì)胞上一種重要的鉀離子通道。當(dāng)淋巴細(xì)胞受到刺激時，細(xì)胞表面的鉀通道可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子濃度以及膜電位，在淋巴細(xì)胞的激活、增殖、分化和機體整個免疫應(yīng)答起著重要的調(diào)節(jié)作用。

2、>　　星斑川鰈（Platichthys stellatus）屬海洋經(jīng)濟(jì)魚類中的名貴珍稀物種，具有極高的商業(yè)價值。養(yǎng)殖病害頻發(fā)往往會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，直接制約著海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)量和健康發(fā)展。鑒于鉀離子通道在機體免疫應(yīng)答機制中所起的關(guān)鍵作用，深入了解魚類非特異性免疫應(yīng)答及調(diào)控機制，對于豐富魚類免疫學(xué)的基本內(nèi)容與基礎(chǔ)理論，為海洋魚類健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)都有著重要的科學(xué)價值與現(xiàn)實意義。目前，離子通道蛋白對免疫系統(tǒng)功能調(diào)控的研究已成為

3、國內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱點。
　　本文以經(jīng)濟(jì)魚類星斑川鰈的腦cDNA為模板，利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了星斑川鰈SKCa2基因的全長序列，cDNA長2346bp，其中5'端非編碼區(qū)153bp，3'端非編碼區(qū)135bp，開放閱讀框2055bp，共編碼685個氨基酸。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和氨基酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)星斑川鰈SKCa2與虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）的SKCa2同源性最高，相似性達(dá)到了96.3％。使用D

4、AS和protscale服務(wù)器對SKCa2進(jìn)行跨膜區(qū)和疏水區(qū)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)星斑川鰈SKCa2具有六個跨膜結(jié)構(gòu)域(S1-S6)和一個孔道區(qū)（P區(qū)）。P區(qū)位于S5和S6之間，其上有一段高度保守的特征序列“TXXTXGYG”，且有一個離子通道阻斷劑—蜂毒明肽(apamin)的作用位點。通過KinasePhos服務(wù)器對SKCa2氨基酸的激酶磷酸化位點預(yù)測以及其他物種的SKCa2結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，SKCa2氨基酸序列上存在多個PKA和PKC磷酸化位點。在

5、C末端還存在一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合域CaMBD。
　　通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，星斑川鰈的血液、心臟、肝臟、鰓、脾臟、腸、胃、腦、頭腎、皮膚和肌肉等組織中均有SKCa2基因表達(dá)，并且表達(dá)存在組織特異性，在血液和鰓中的表達(dá)量較高，其次為心臟、肝臟、頭腎、脾臟、皮膚和肌肉，在腸、腦和胃中的表達(dá)量相對較低。經(jīng)LPS感染后，SKCa2在血液、頭腎、脾臟、后腸、皮膚和肝臟中的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明SKCa2在免疫器官組織執(zhí)行免疫應(yīng)答機制的過程中具有重

6、要的調(diào)節(jié)作用。
　　使用LPS和LPS+Apamin刺激體外培養(yǎng)的星斑川鰈淋巴細(xì)胞，研究SKCa2通道對淋巴細(xì)胞增殖及呼吸爆發(fā)活性的影響。在細(xì)胞增殖的研究中發(fā)現(xiàn)，LPS+Apamin刺激組的OD570值低于LPS刺激組的OD570值，說明Apamin阻斷了SKCa2通道之后，引起淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平降低，證實了SKCa2通道在淋巴細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用。在呼吸爆發(fā)活性的研究巾發(fā)現(xiàn)，LPS+Apamin刺激組OD620值與LPS刺激