數(shù)字化載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的制備及生物學(xué)研究.pdf

1、研究背景:
　　 在世界范圍內(nèi)，由于創(chuàng)傷，腫瘤和感染等原因造成的骨缺損每年都在折磨著眾多的患者，需要進(jìn)行植骨移植。然而，臨床上對于大面積污染性骨缺損的治療使用常規(guī)的植骨材料有可能因繼發(fā)感染而致骨移植失敗。且臨床上細(xì)菌耐藥性的問題日益嚴(yán)重，植骨材料加載抗生素的作用越來越局限化，從而對抗菌劑提出了更高的要求。近年來，無機(jī)抗菌材料以其有效的抗菌性、較高的安全性和穩(wěn)定性引起了廣泛關(guān)注。無機(jī)抗菌劑與有機(jī)天然抗菌劑相比，具有抗菌譜廣、長效持

2、久、不產(chǎn)生耐藥性、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。Ag+的抗菌性能是金屬離子中最強(qiáng)的，亦是應(yīng)用最早、最成熟的無機(jī)抗菌劑。
　　 長期以來，研制具有抗菌功能的生物材料替代自體骨修復(fù)骨缺損一直是醫(yī)學(xué)和材料學(xué)領(lǐng)域的重要課題。而骨組織工程為骨缺損，特別是復(fù)雜結(jié)構(gòu)的骨缺損的修復(fù)帶來了新的期盼。骨組織工程包括三個(gè)關(guān)鍵因素:信號分子(骨生長因子、骨誘導(dǎo)因子)、支架材料和靶細(xì)胞。其中支架材料的選擇是骨組織工程的核心問題。目前的支架材料主要有天然的支架材料、人

3、工合成的支架材料以及復(fù)合材料。
　　 珊瑚羥基磷灰石(CHA)是由天然珊瑚通過“水熱反應(yīng)”轉(zhuǎn)變而來的羥基磷灰石，保留了天然珊瑚的多孔結(jié)構(gòu)，生物相容性好，具有較大的孔徑、較高的孔隙率和孔隙交通率。大量的文獻(xiàn)表明珊瑚類人工骨為一類較為理想的骨替代材料，并因?yàn)樗牧己媒M織相容性和三維多孔結(jié)構(gòu)，也被認(rèn)為是有前途的組織工程支架材料和載體。但CHA人工骨脆性較大，無法根據(jù)骨缺損的形狀個(gè)性化地制備出人工骨支架，存在一定不足。
　　 左

4、旋-聚乳酸(L-polylacticacid，L-PLA)是一種已在醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用的有機(jī)高分子材料，作為人體的植入物已經(jīng)通過美國食品藥品管理局的認(rèn)證，并已被廣泛用于內(nèi)固定裝置例如骨板、骨釘、手術(shù)縫合線等。其優(yōu)點(diǎn)是可降解性，良好的細(xì)胞相容性，容易塑形。
　　 然而，單一類型材料(天然支架或人工合成支架)一般難以滿足骨組織工程用于細(xì)胞外支架材料的要求。天然材料具有生物相容性好、細(xì)胞識別信號、利于細(xì)胞黏附增殖;人工材料雖然缺乏細(xì)胞信號

5、，但具有天然材料所不足的可以大規(guī)模生產(chǎn)、可以設(shè)計(jì)和控制結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和降解時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。通過一定的方法將由幾種不同材料相結(jié)合形成，或者由生物材料與生長因子復(fù)合而成，復(fù)合材料在性能上互相取長補(bǔ)短，在實(shí)際應(yīng)用中已經(jīng)取得了良好效果。天然生物衍生材料、高分子材料、陶瓷材料既可以作為復(fù)合材料的基材，又可作為其增強(qiáng)體和填料，他們互相搭配和組合形成大量性質(zhì)各異的復(fù)合材料。
　　 快速成形技術(shù)(RapidPrototypingTechnology

6、，RPT)是種基于離散堆積成型思想的新型成形技術(shù)，可快速、高精度地從CT數(shù)據(jù)完成快速成形生物模型的制造。它自20世紀(jì)80年代產(chǎn)生以來得到了迅速的發(fā)展，是制造技術(shù)領(lǐng)域出現(xiàn)的一次重大突破，其對制造業(yè)的影響完全可以與數(shù)控技術(shù)相媲美。近年來，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可以制造任意復(fù)雜形狀的三維實(shí)體模型，為骨組織工程支架的個(gè)性化制造提供了可能。
　　 如果能夠利用快速成形技術(shù)，在保留珊瑚羥基磷灰石的天然微孔樣結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，載入銀離子，根據(jù)骨缺

7、損的形態(tài)，個(gè)性化地制備出具有抗菌性人工骨支架修復(fù)材料，這將極大地促進(jìn)抗菌性骨組織工程支架的發(fā)展。
　　 本研究將珊瑚羥基磷灰石(CHA)，通過溶液離子交換法，成功載入銀離子，制備出不同含銀量的載銀羥基磷灰石抗菌粉末，與聚乳酸(PLA)混合后，通過選擇性激光燒結(jié)快速成形制備出具有特殊形狀的數(shù)字化載銀抗菌人工骨(CHA-Ag)支架材料。通過系列實(shí)驗(yàn)，研究CHA/PLA-Ag人工骨支架材料的理化學(xué)特性、抗菌性、生物相容性，通過修復(fù)動物

8、大段污染性骨缺損模型，探討其應(yīng)用于感染性骨缺損的可行性。
　　 研究目的:
　　 1、研究載銀數(shù)字化珊瑚羥基磷灰石/聚乳酸人工骨的制備及性能表征。
　　 2、研究載銀數(shù)字化珊瑚羥基磷灰石/聚乳酸人工骨的細(xì)胞相容性。
　　 3、研究載銀數(shù)字化珊瑚羥基磷灰石/聚乳酸人工骨體外抑菌性。
　　 4、研究載銀數(shù)字化珊瑚羥基磷灰石/聚乳酸人工骨載銀量及體外釋放速率。
　　 5、探討載銀數(shù)字化珊瑚羥基磷

9、灰石/聚乳酸人工骨的組織相容性與修復(fù)大段污染性骨缺損的動物實(shí)驗(yàn)。
　　 研究方法:
　　 1.將珊瑚羥基磷灰石，經(jīng)球磨機(jī)球磨后成細(xì)顆粒粉末狀，過目篩后取顆粒大小為140-200μm，分別放在含有10-2、10-3、10-4、10-5mmol/LAgNO3溶液避光浸泡，制備出含不同質(zhì)量銀的載銀羥基磷灰石粉末，然后將其與L-PLA以3:1質(zhì)量比混均后，采用Simpleware3.1軟件，通過CAD構(gòu)建一數(shù)字化的圓柱形模型，通

10、過數(shù)控轉(zhuǎn)換，將其生成STL格式的文件，導(dǎo)入快速成型機(jī)中，采用選擇性激光燒結(jié)快速成型的工藝，將數(shù)字化的模型制備成制備出含不同質(zhì)量銀的載銀羥基磷灰石人工骨支架材料(CHA/PLA-Ag)。采用掃描電鏡、紅外光譜儀、X射線衍射儀對數(shù)字化載銀羥基磷灰石抗菌人工骨進(jìn)行理化、結(jié)構(gòu)分析。
　　 2.體外抗菌性能實(shí)驗(yàn)
　　 2.1抑菌圈實(shí)驗(yàn):復(fù)蘇金黃色葡萄球菌ATCC25923及大腸桿菌ATCC25922，接種于含LB液體培養(yǎng)基試管中，

11、于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1d備用。取浸泡10-2、10-3、10-4、10-5mmol/LAgNO3所制備的5種珊瑚羥基磷灰石人工骨圓柱狀材料各1粒，分別置于接種有金黃色葡萄球菌(接種量為1.5×107CFU)及大腸桿菌(接種量為1.5×107CFU)的90mm的LB瓊脂培養(yǎng)基中，青霉素液滴作為陽性對照組;于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，測量抑菌圈，記錄抑菌圈大小。每個(gè)菌株重復(fù)6次。
　　 2.2菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn):將金黃色葡萄球菌及

12、大腸桿菌配制成濃度為3×108CFU/mL的細(xì)菌懸液。取100μL細(xì)菌懸液分別滴于載銀及未載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨材料表面，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。將材料置于5mLPBS液中，在漩渦振蕩儀上振蕩5min，洗脫細(xì)菌。取100μL洗脫液用PBS稀釋至適當(dāng)濃度，推平板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后計(jì)平板菌落數(shù)及計(jì)算抗菌率。每個(gè)菌種實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。
　　 3.參照GB/T16886.1-2001idtISO10993-1:19

13、97和GB/T16175-2008,對載銀羥基磷灰石人工骨支架材料，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血反應(yīng)、急性毒性實(shí)驗(yàn)、遲發(fā)性超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)評價(jià)。
　　 3.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察載銀羥基磷灰石人工骨支架材料浸提液對L-929細(xì)胞形態(tài)的變化，采用MTT法檢測對L-929細(xì)胞增殖情況的影響，以評價(jià)其細(xì)胞毒性。
　　 3.2溶血反應(yīng):檢測載銀羥基磷灰石人工骨支架材料浸提液的對新西蘭大白兔溶血率，評價(jià)材料的溶血

14、反應(yīng)。
　　 3.3急性毒性實(shí)驗(yàn):小鼠腹腔注射載銀羥基磷灰石人工骨支架材料的浸提液，觀察小鼠的毒性反應(yīng)，評價(jià)材料的毒性。
　　 3.4遲發(fā)性超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn):豚鼠皮內(nèi)注射載銀羥基磷灰石人工骨支架材料浸提液，觀察豚鼠皮膚過敏反應(yīng)情況，評價(jià)材料的致敏反應(yīng)。
　　 4.將不同質(zhì)量銀的載銀羥基磷灰石人工骨支架材料，采用原子吸收光譜儀
　　 對材料進(jìn)行Ag+含量分析。將10-3組載銀羥基磷灰石人工骨支架材料分別放置于初

15、始pH值為7.4的15mL模擬體液(stimulatedbodyfluid，SBF)中，在37℃恒溫箱中降解，并分別于1d、4d、7d、14d、21d、28d、49d檢測其在模擬體液中的銀離子釋放量和速度。
　　 5.于新西蘭大白兔脛骨干骺端構(gòu)建5mm×15mm的污染性腔隙性骨缺損，實(shí)驗(yàn)組植入10-3mmol/LAgNO3載銀羥基磷灰石人工骨支架材料修復(fù)骨缺損，對照組骨缺損區(qū)植入未載銀的羥基磷灰石/聚乳酸人工骨支架材料，空白對照

16、組骨缺損區(qū)不植入任何材料。于術(shù)后第1天，第4周、8周、12周行X線攝片，觀察骨缺損修復(fù)及骨塑形情況。參照Lane-SandhuX線評分標(biāo)準(zhǔn)對各組脛骨缺損的骨修復(fù)程度評分，標(biāo)本行HE染色組織學(xué)觀察以了解骨修復(fù)情況。
　　 結(jié)果
　　 1.采用珊瑚羥基磷灰石(CHA)粉末浸泡不同濃度的硝酸銀溶液，通過溶液離子交換法，制備出不同含銀量的載銀羥基磷灰石，再將不同的載銀CHA粉末與左旋聚乳酸(L-PLA)按3:1質(zhì)量比混均，并通過

17、CAD和選擇性激光燒結(jié)快速成形技術(shù)，可以成功制備出具有特殊形狀的數(shù)字化載銀抗菌人工骨支架材料。數(shù)字化CHA-Ag人工骨制備后為灰白色，其中浸泡10-2mol/LAgN03載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨為棕黑色，其粉末制備成型前仍為灰白色，考慮為其載銀量相對較高，制備成型時(shí)銀離子經(jīng)激光束強(qiáng)光照射后與氧結(jié)合成氧化銀所致。制備的人工骨支架表面粗糙，呈規(guī)整的小圓柱體狀，粗細(xì)均勻，可見微孔結(jié)構(gòu)。各組材料的抗壓強(qiáng)度均大于1Mpa。
　　 2.體外

18、抗菌實(shí)驗(yàn)。抑菌圈實(shí)驗(yàn):浸泡10-4mmol/LAgN03、10-5mmol/LAgNO3濃度硝酸銀所制備的數(shù)字化CHA-Ag人工骨材料在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌圈產(chǎn)生。浸泡10-2mmol/LAgN03、10-3mmol/LAgN03濃度硝酸銀所制備的數(shù)字化CHA-Ag人工骨材料24h對2種細(xì)菌均產(chǎn)生抑菌圈，其中浸泡10-2mmol/LAgNO3載銀人工骨材料對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為(13.0

19、0±0.71)mm及(12.30±0.71)mm，浸泡10-3mmol/LAgN03載銀人工骨材料分別平均為(11.51±0.09)mm及(11.00±0.15)mm。金黃色葡萄球菌各材料間以及與青霉素對照組比較，單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組方差不齊(F=5.149，P=0.020)，組間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95370.727，P=0.000)，兩兩比較均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。大腸桿菌各材料間以及與青霉素對照組

20、比較，單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組方差齊性(F=1.585，P=0.237)，組間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2692.000，P=0.000)，兩兩比較均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 菌落數(shù)實(shí)驗(yàn):金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與浸泡10-2mmol/LAgNO3載銀CHA-Ag人工骨材料接觸后無生長繁殖，抗菌率為100％;與浸泡10-3、10-4、10-5mmol/LAgNO3載銀CHA-Ag人工骨材料接觸后生長減

21、緩，表明有抗菌作用，對金黃色葡萄球菌抗菌率分別為99.99±0.00％、49.42±0.28％及22.18±0.26％;對大腸桿菌抗菌率分別為99.99±0.00％、44.66±0.44％及21.09±0.32％。金黃色葡萄球菌各材料間比較，單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組方差不齊(F=6.154，P=0.004)，組間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2E+007，P=0.000)，兩兩比較均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。大腸桿菌各材

22、料間比較，單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組方差不齊(F=15.792，P=0.000)，組間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1E+007，P=0.000)，兩兩比較均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3.100％浸泡10-2mol/LAgNO3的CHA-Ag人工骨浸提液作用于L929細(xì)胞2、4、7d，大部分細(xì)胞死亡，呈圓形，生長欠佳，對細(xì)胞有毒性，毒性分級為3級;而10-3、10-4、10-5mmol/LAgNO3的CHA

23、-Ag人工骨浸提液作用于L929細(xì)胞2、4、7d后，細(xì)胞生長旺盛，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞呈典形的梭形，貼壁良好，毒性分級分別為1級、0級、0級。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10-3mmol/LAgNO3的CHA-Ag人工骨材料浸提液的細(xì)胞毒性均為0級;溶血率為:2.22％，小于5％，符合生物醫(yī)學(xué)要求;急性毒性程度分級均為0級;致敏反應(yīng)記分均為0分。表明10-3mmol/LAgNO3的CHA-Ag人工骨材料符合生物材料醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)。
　　

24、 4.10-2、10-3、10-4、10-5組Ag+含量分別為2310.520±33.418、318.692±1.763、67.535±0.191及6.050±0.028μg/g，單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組方差不齊(F=9.005，P=0.001)，組間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25847.567，P=0.000)，兩兩比較均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。10-3材料在體外SBF中Ag+呈緩慢釋放趨勢，在最初浸泡7d內(nèi)釋放

25、速度較快，之后釋放速度逐漸減慢。
　　 5.各組實(shí)驗(yàn)動物術(shù)后進(jìn)食基本正常，2周后均能自由活動。其中10-3CHA/PLA-Ag組術(shù)口無明顯紅腫，無裂開，無滲液流膿，愈合良好;CHA/PLA組術(shù)口愈合差，裂開，術(shù)口紅腫滲液流膿，取分泌物行細(xì)菌培養(yǎng)，為金黃色葡萄球菌，術(shù)后2周術(shù)口軟組織腫脹減輕，逐漸愈合;空白對照組術(shù)口輕度紅腫，無明顯滲液流膿，1周后術(shù)口愈合良好。術(shù)后3月未出現(xiàn)動物死亡，未出現(xiàn)病理性骨折。大體觀實(shí)驗(yàn)組及CHA/PLA

26、組兔脛骨缺損完全愈合;空白對照組缺損基本無骨修復(fù)作用，由纖維組織充填。實(shí)驗(yàn)組、CHA/PLA組及空白對照組的放射學(xué)檢查評分同一時(shí)間點(diǎn)比較，單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組方差齊性(P＞0.05)，組間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中實(shí)驗(yàn)組、CHA/PLA組各時(shí)間點(diǎn)評分差別無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明實(shí)驗(yàn)組、CHA/PLA組的骨修復(fù)作用無顯著差異，而實(shí)驗(yàn)組、CHA/PLA組與空白對照組各時(shí)間點(diǎn)評分差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意

27、義(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組、CHA/PLA兩組均高于空白對照組的評分，說明實(shí)驗(yàn)組、CHA/PLA組有明顯的骨修復(fù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究采用珊瑚羥基磷灰石(CHA)粉末浸泡不同濃度的硝酸銀溶液，通過溶液離子交換法，制備出不同含銀量的載銀羥基磷灰石，再將不同的載銀CHA粉末與左旋聚乳酸(L-PLA)按3:1質(zhì)量比混均，并通過CAD和選擇性激光燒結(jié)快速成形技術(shù)，成功制備出具有特殊形狀的數(shù)字化載銀抗菌人工骨支架材

28、料，其工藝簡便易行。并通過一系列方法對數(shù)字化載銀的珊瑚羥基磷灰石/聚乳酸人工骨支架材料進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)，本方法充分利用和保留了珊瑚天然的微孔樣結(jié)構(gòu)，各組材料的抗壓強(qiáng)度均大于1Mpa。
　　 2.載銀CHA/PLA-Ag人工骨材料體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，其對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌均有抗菌作用，其中浸泡10-4、10-5mmo/LAgNO3載銀CHA-Ag人工骨材料體外對上述2種細(xì)菌抑菌圈實(shí)驗(yàn)為陰性，菌落數(shù)實(shí)驗(yàn)表明其抗菌率均低于90％，不符

29、合醫(yī)用抗菌材料標(biāo)準(zhǔn)。而浸泡10-2、10-3mol/LAgNO3的載銀人工骨材料體外對上述2種細(xì)菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈，菌落數(shù)實(shí)驗(yàn)表明其抗菌作用明顯，抗菌率均大于90％，具有良好的抗菌性能，符合醫(yī)用抗菌材料標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3.載銀人工骨支架材料體外生物學(xué)試驗(yàn)表明浸泡10-2mmol/LAgNO3所制備的CHA/PLA-Ag人工骨材料浸提液有細(xì)胞毒性，不符合生物材料醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)。而10-3、10-4、10-5mol/LAgNO3的CHA/P

30、LA-Ag人工骨浸提液對細(xì)胞毒性分級分別為1級、0級、0級。表明材料隨著載銀量增高，對細(xì)胞毒性越大。10-3、10-4、10-5mol/LAgNO3的CHA/PLA-Ag人工骨材料符合生物材料醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)，其中10-3mmol/LAgNO3載銀人工骨支架材料無溶血反應(yīng)、無全身毒性及致敏性，具有良好的生物相容性。
　　 4.載銀CHA-Ag人工骨材料的載銀量及釋放實(shí)驗(yàn)表明人工骨材料的載銀量隨著溶液中銀離子濃度的增加而增加，支架材料中銀

31、離子能保持長時(shí)間的緩釋特性，從而能有效地避免銀離子早期大量釋放，保持長時(shí)間的持續(xù)緩慢釋放，有效地減少銀離子對組織細(xì)胞的毒性作用。
　　 5.在修復(fù)兔脛骨干骺端污染性腔隙性骨缺損模型中，10-3mmol/LAgNO3所制備的載銀人工骨支架材料具有良好地抑制骨感染及修復(fù)骨缺損效果，表明羥基磷灰石人工骨載銀后與左旋聚乳酸復(fù)合后具有良好的抗菌性、生物相容性和骨傳導(dǎo)作用，未明顯影響成骨作用，是一種具有良好應(yīng)用前景的新型抗菌性骨修復(fù)替代材料