高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)溶菌酶結(jié)構(gòu)、活性的影響.pdf

1、高強(qiáng)度聚焦超聲（High intensity focused ultrasound，HIFU）是一種新型的微無創(chuàng)治療技術(shù)，已在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。HIFU治療的主要作用機(jī)制包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及空化效應(yīng)等。目前，關(guān)于HIFU對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性的影響的報(bào)道少之又少。因此，本文使用溶菌酶作為研究蛋白，利用質(zhì)譜、圓二色光譜（CD光譜）、熒光光譜、核磁共振氫譜(1H-NMR)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以及被動(dòng)空化檢測(cè)（P

2、assive Cavitation Detection PCD）等方法，研究了HIFU處理溶菌酶后對(duì)溶菌酶結(jié)構(gòu)、活性的影響，并初步探討了HIFU影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性的作用機(jī)制。
　　目的:
　　1.探討高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)一種蛋白質(zhì)—溶菌酶結(jié)構(gòu)、活性的影響，以及相應(yīng)的輻照參數(shù)。
　　2.從聲空化和溫升的角度探討高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)溶菌酶結(jié)構(gòu)、活性影響的機(jī)制。
　　方法:
　　1.分別使用頻率0.94 MHz、聲功率

3、500W、脈沖重復(fù)頻率4 Hz、占空比10％的脈沖高強(qiáng)度聚焦超聲輻照溶菌酶溶液10s、2min、3min、4min、5min。以及使用頻率0.94 MHz、聲功率分別為100W、200W、300W、400W、500W，脈沖重復(fù)頻率4 Hz、占空比10%的脈沖高強(qiáng)度聚焦超聲輻照溶菌酶溶液5min。4oC保存?zhèn)溆谩?br>　　2.利用質(zhì)譜、圓二色光譜（CD光譜）、熒光光譜、核磁共振氫譜(1H-NMR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

4、方法，研究高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)溶菌酶結(jié)構(gòu)的影響。采用溶菌酶試劑盒測(cè)定輻照前后溶菌酶活性的變化情況。
　　3.采用PCD系統(tǒng)采集HIFU輻照過程中焦域處的聲發(fā)射信號(hào)（acoustic emissions，主要為空化信號(hào)），對(duì)該信號(hào)進(jìn)行快速傅立葉變換（Fast Fourier Transformation，F(xiàn)FT）然后進(jìn)行帶通濾波（3~7MHz）后用帶阻濾波器濾除通帶內(nèi)的諧波（3f0、4f0、5f0、6f0、7f0），得到非諧波的寬帶噪聲

5、，然后對(duì)寬帶噪聲進(jìn)行均方根（Root Mean Square，RMS）運(yùn)算，得到RMS隨輻照時(shí)間的變化曲線。進(jìn)而得到輻照過程中的累積空化劑量（ICD）。
　　4.使用溫度采集系統(tǒng)記錄HIFU輻照中焦域處的溫度，并繪制其隨輻照時(shí)間變化的曲線。
　　結(jié)果:
　　1.高強(qiáng)度聚焦超聲處理后，質(zhì)譜無明顯變化，表明超聲對(duì)溶菌酶一級(jí)結(jié)構(gòu)無影響；CD光譜無明顯變化，表明超聲對(duì)溶菌酶二級(jí)結(jié)構(gòu)無影響；而熒光光譜顯示，熒光強(qiáng)度減弱，且熒光強(qiáng)

6、度隨著HIFU輻照功率、輻照時(shí)間的增加逐漸減弱。說明溶菌酶色氨酸（Trp）周圍的疏水結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，且隨著 HIFU輻照功率、輻照時(shí)間的增加，疏水結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞；SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)超聲輻照后溶菌酶出現(xiàn)支鏈降解，且隨著HIFU輻照功率、輻照時(shí)間的增加，目標(biāo)條帶逐漸變細(xì)變淡；1H-NMR結(jié)果顯示，經(jīng)超聲輻照后溶菌酶色氨酸發(fā)生了化學(xué)位移，且隨著HIFU輻照功率、輻照時(shí)間的增加，化學(xué)位移也有所增加。
　　2.高強(qiáng)度聚焦超聲處理

7、后，溶菌酶活性均出現(xiàn)降低現(xiàn)象。且隨著HIFU輻照功率、輻照時(shí)間的增加，溶菌酶活性逐漸降低，由最初的200U/ml下降到23.2U/ml。
　　3.HIFU輻照過程中，存在空化現(xiàn)象，且隨著輻照功率的增加，累積空化劑量隨之增加，表現(xiàn)在溶菌酶結(jié)構(gòu)方面的影響，色氨酸熒光強(qiáng)度隨之減弱，化學(xué)位移隨之增加。表現(xiàn)在溶菌酶活性方面的影響，溶菌酶的活性逐漸減弱。
　　4.HIFU輻照過程中，焦域處溫度變化幅值不大,初始溫度18oC， HIFU輻

8、照產(chǎn)生的最高溫度為23.3oC，其溫度的變化不足以引起溶菌酶變性。
　　結(jié)論:
　　1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高強(qiáng)度聚焦超聲可以改變?nèi)芫傅母呒?jí)結(jié)構(gòu)，即溶菌酶的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。但對(duì)于溶菌酶的一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)無明顯改變。這可能與超聲參數(shù)、蛋白質(zhì)本身的超聲耐受性不同有關(guān)。
　　2、HIFU輻照溶菌酶后，溶菌酶的活性降低，且隨著輻照時(shí)間增長(zhǎng)、輻照功率增加活性越來越弱。
　　3、HIFU輻照過程中存在空化現(xiàn)象，空化產(chǎn)生的自由基，主要