長時程心室顫動犬病理生理變化及縫隙連接蛋白調(diào)節(jié)劑ZP123的干預(yù)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 長時程心室顫動犬生理和生化指標(biāo)的變化及復(fù)蘇后心功能不全與基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其抑制物-1表達(dá)的研究
　　目的:
　　1.通過對長時程心室顫動犬體內(nèi)生理和生化過程的變化進(jìn)行研究，試圖從病理生理方面揭示室顫發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在規(guī)律;
　　2.通過心室顫動復(fù)蘇動物模型研究TIMP-1與MMP-9的表達(dá)變化;
　　3.研究TIMP-1與MMP-9的表達(dá)變化對心室顫動復(fù)蘇后心功能的

2、影響。
　　方法:
　　1.心室顫動動物模型的構(gòu)建和分組
　　成年犬30只，(體重13.5-18.5kg)，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(n=10)，8min室顫組(n=10)和12min室顫組(n=10)。以3％戊巴比妥納30mg/kg腹腔內(nèi)麻醉成功后，仰臥位固定，肢體去毛后粘貼三導(dǎo)聯(lián)電極，外聯(lián)多導(dǎo)電生理儀以取得體表心電圖信號。
　　2.各組動物的生理生化指標(biāo)、心功能及心肌TIMP-1和MMP-9濃度的監(jiān)測
　

3、　2.1 血流動力學(xué)參數(shù)
　　連續(xù)記錄室顫前、室顫發(fā)生后12分鐘內(nèi)及復(fù)蘇后犬主動脈收縮壓、主動脈舒張壓、主動脈壓力和右房壓。冠脈灌注壓為AODP與RAP的差值，室顫后復(fù)蘇前為AOP與RAP的差值。
　　2.2 血液生化、血?dú)夥治黾澳?抗凝系列指標(biāo)
　　在心室顫動前，室顫后每隔1min取動靜脈血，動脈血取得后立即行血?dú)夥治鰷y定，測定其動脈血氧分壓、二氧化碳分壓、動脈血pH值、乳酸濃度等指標(biāo);靜脈血取得后應(yīng)用血液生化儀測

4、定肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、血清鉀離子、鈉離子、氯離子、鈣離子濃度等血液生化指標(biāo)，凝血/抗凝系列指標(biāo)則包括纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)b）、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ))、和D-二聚體(D-Dimer)濃度。
　　2.3 超聲心動圖測量
　　動物致顫前和恢復(fù)自主循環(huán)1小時后行胸二維超聲分別測量致顫前，ROSC后左房內(nèi)徑，左室舒張期內(nèi)徑和左室射血分?jǐn)?shù)。
　　2.4 心肌TIMP-

5、1和MMP-9測定
　　室顫維持8min或12min后，進(jìn)行心肺復(fù)蘇和電除顫。免疫組化和Western Blot技術(shù)檢測假手術(shù)組、心室顫動8min組、12min組復(fù)蘇成功犬心肌TIMP-1和MMP-9的水平。
　　3.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所用數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05

6、為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　實驗過程中，30只犬中。26只一次誘發(fā)心室顫動成功，4只二次誘發(fā)心室顫動成功，均持續(xù)12min。復(fù)蘇后8min室顫組和12min室顫組分別有7只和5只動物恢復(fù)自主循環(huán)。
　　1.各組動物基礎(chǔ)狀態(tài)各項指標(biāo)比較
　　實驗前各組動物的體重，心率，左心房內(nèi)徑、左心室內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)以及血流動力學(xué)、血?dú)夥治?、凝血指?biāo)和血生化指標(biāo)均無顯著性差異。
　　2.室顫后各項生理生化指標(biāo)<

7、br>　　2.1 血流動力學(xué)參數(shù)。
　　2.2 血液生化指標(biāo)。
　　2.3 血?dú)夥治鲋笜?biāo)。
　　2.4 凝血/抗凝系列指標(biāo)
　　3.動物恢復(fù)自主循環(huán)后血流動力學(xué)和心功能情況。
　　4.MMP-9和TIMP-1與心功能的關(guān)系
　　TIMP-1的水平與LAD負(fù)相關(guān)（r=-0.83; P＜0.05），與LVDd呈負(fù)相關(guān)(r=-0.96，P＜0.05)，與LVEF呈正相關(guān)（r=0.85，P＜0.05），即隨著

8、TIMP-1的逐漸減少LAD，LVDd逐漸增大，LVEF逐漸降低。
　　結(jié)論:
　　1.長時程心室顫動的病理過程呈現(xiàn)階段性變化，漸次出現(xiàn)血流動力學(xué)障礙，酸堿平衡紊亂，凝血和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn);
　　2.室顫復(fù)蘇后存在TIMP-1和MMP-9的表達(dá)失衡，此失衡可能與心功能的降低相關(guān)。
　　第二部分 縫隙連接蛋白調(diào)節(jié)劑ZP123對犬不同時程心室顫動的作用
　　目的:
　　1.根據(jù)前述心室顫動的臨床和生化階段，

9、評估Cx43在心室顫動不同階段表達(dá)與分布的變化;
　　2.縫隙連接蛋白調(diào)節(jié)劑ZP123在室顫不同階段對縫隙連接蛋白Cx43的影響;
　　3.觀察ZP123對不同時程室顫除顫能量及除顫成功率的影響;
　　4.評價ZP123對不同時程室顫復(fù)蘇率的影響。
　　方法:
　　1.實驗動物
　　隨機(jī)選取健康成年家犬60只，雌雄不限，體重13.5-18.5kg，隨機(jī)分為五組。
　　2.室顫模型的構(gòu)建
　

10、　3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈靜注麻醉，氣管插管，連接呼吸機(jī)，在SIMV模式下調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)為:潮氣量10-15ml/kg體重，呼吸頻率16-20次/分，吸入氧濃度(FiO250％-80％)，吸氣與呼氣時間比為1∶1.5-2.0，呼氣末正壓為5cmH2O(0.49Kpa)。
　　將體外電刺激器火線端與零線端的導(dǎo)電針頭分別插入心前區(qū)左上方與右下方的皮下，以80V持續(xù)刺激5S可以成功的誘發(fā)持續(xù)室顫。
　　3.心肺復(fù)蘇

11、
　　室顫模型成功建立后，即撤除呼吸機(jī)，待室顫持續(xù)8min和12min后，立即開始胸外心臟按壓，同時接氣囊，按壓通氣比為30∶2，5個復(fù)蘇周期即2分鐘后，進(jìn)行心律評估，仍為室顫的給予雙向非同步電除顫，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果將首次除顫能量為70J，若未能終止，則將除顫能量依次遞增為100J、150J，以后的能量均為150J。
　　4.血流動力學(xué)指標(biāo)及心電圖參數(shù)
　　記錄室顫前及心肺復(fù)蘇后的各項血流動力學(xué)指標(biāo):主動脈收縮壓、主動脈

12、舒張壓、主動脈平均壓;右心房收縮壓、右心房舒張壓、右心房平均壓，冠狀動脈灌注壓。
　　5.平均除顫能量、除顫成功率和自主循環(huán)恢復(fù)率
　　記錄室顫心肺復(fù)蘇過程中各組動物的平均除顫能量（各組動物復(fù)蘇成功后總除顫能量/復(fù)蘇成功動物只數(shù)）、各除顫能量級除顫成功率(70J、100J、150J)和自主循環(huán)恢復(fù)率，并加以分析比較。
　　6.免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡
　　存活時間達(dá)到一小時的動物用10％氯化鉀處死，迅速開胸，沿

13、左心室長軸留取0.5cm3大小的左心室游離壁心肌組織數(shù)塊，一部分用4％多聚甲醛固定用于免疫熒光分析，另一部分放入液氮中速凍然后轉(zhuǎn)存至-80℃冰箱凍存，用于Western-Blot分析。
　　7.Western-Blot分析
　　提取蛋白，上樣，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳結(jié)束后，把目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。
　　結(jié)果:
　　1.犬的一般狀況
　　各組動物基礎(chǔ)狀態(tài)無統(tǒng)計學(xué)差異;8min藥物組有8只動物達(dá)

14、自主循環(huán)恢復(fù)并存活1小時，8min常規(guī)復(fù)蘇組有6只動物達(dá)自主循環(huán)恢復(fù)并存活1小時。12min藥物組有5只動物達(dá)自主循環(huán)恢復(fù)并存活1小時，12min常規(guī)復(fù)蘇組有4只動物達(dá)自主循環(huán)恢復(fù)并存活1小時。
　　2.各組動物達(dá)到ROSC后血流動力學(xué)參數(shù)以及心電圖參數(shù)比較
　　室顫模型建立成功后，于8min和12min后進(jìn)行心肺復(fù)蘇和非同步電除顫，記錄分析各組動物達(dá)到ROSC后血流動力學(xué)參數(shù)以及心電圖參數(shù)，結(jié)果顯示:各組動物達(dá)到ROSC后

15、的血流動力學(xué)參數(shù)總體之間無差異(P＞0.05)。
　　3.各組動物平均除顫能量、除顫成功率和自主循環(huán)恢復(fù)率
　　8min組:藥物組平均除顫能量明顯低于常規(guī)復(fù)蘇組(427.2±126.4J vs.560.7±128.9J，P=0.045)，各能量級除顫成功率均明顯高于常規(guī)復(fù)蘇組。
　　12min組:藥物組動物的除顫能量明顯低于12min常規(guī)復(fù)蘇組。
　　4.免疫熒光結(jié)果
　　假手術(shù)組Cx43熒光信號強(qiáng)，形態(tài)清

16、晰，分布均勻，排列有序;常規(guī)復(fù)蘇組Cx43熒光信號弱，形態(tài)模糊，排列紊亂，呈現(xiàn)不均一分布;藥物組Cx43的熒光信號較強(qiáng)，形態(tài)相對清晰，不均一分布的程度較常規(guī)復(fù)蘇組減輕。
　　12min常規(guī)復(fù)蘇組Cx43熒光信號的面積百分比以及積分光密度值明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;12min常規(guī)復(fù)蘇組的Cx43熒光信號的面積百分比以及積分光密度值明顯低于12min藥物組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。12min藥物組Cx43熒光信號的面積百分比以及積

17、分光密度值明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.Western-Blot結(jié)果:
　　圖像定量分析顯示，8min常規(guī)復(fù)蘇組Cx43表達(dá)水平（0.75±0.07）較假手術(shù)組（1.07±0.04）及8min藥物組Cx43表達(dá)水平（0.95±0.06）明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);12min常規(guī)復(fù)蘇組Cx43表達(dá)水平（0.58±0.05）較假手術(shù)組（1.07±0.04）及12min藥物組Cx43表達(dá)水平（0.7