eNOS基因治療對肝硬化大鼠肝竇容積和肝內(nèi)阻力的影響.pdf

1、隨著對門靜脈高壓癥(PHT)發(fā)病機理研究的深入,現(xiàn)在認為由于肝臟結(jié)構(gòu)改變,如肝纖維瘢痕組織和再生結(jié)節(jié)壓迫肝內(nèi)血管,肝細胞腫脹和肝竇收縮狹窄等引起肝內(nèi)血管阻力增加是PHT的始動因素,而內(nèi)臟高動力循環(huán)在維持和加重門靜脈高壓中起非常重要的作用.最新研究表明,肝星形細胞(HSC)也稱Ito細胞或儲脂細胞,在肝纖維化和PHT的形成和發(fā)展中居重要地位,它的收縮或舒張調(diào)節(jié)著肝竇容積的大小.血管收縮物質(zhì)主要是內(nèi)皮素-1(ET-1)和血管擴張物質(zhì)主要是一

2、氧化氮(NO)是調(diào)節(jié)HSC舒縮的重要刺激因子.在肝硬化時,由于肝竇內(nèi)皮細胞(SEC)功能受損,NO合成減少而ET-1含量相對增加,肝內(nèi)ET-1/NO動態(tài)平衡失調(diào),導(dǎo)致HSC和肝竇收縮,從而引起肝內(nèi)阻力增加和門靜脈壓力(PVP)升高.該研究中,我們首次應(yīng)用免疫組化和圖像分析系統(tǒng)定量測定并比較正常肝和硬化肝內(nèi)皮性一氧化氮合酶(eNOS)含量和肝竇容積的變化差異;然后以脂質(zhì)體為載體經(jīng)門靜脈注射將eNOS基因?qū)舜笫笥不蝺?nèi),觀察并比較基因治療

3、后肝內(nèi)eNOS含量的變化和對肝竇容積的影響,以進一步闡明PHT的發(fā)病機理.同時,我們建立了大鼠原位肝臟灌注模型,研究eNOS基因治療后門靜脈對去甲腎上腺素(NE)反應(yīng)性的變化,探討基因治療對肝內(nèi)阻力的影響,為基因治療PHT提供理論和實驗依據(jù).方法:(1)建立四氯化碳(CCl<,4>)肝內(nèi)型肝硬化大鼠模型.分別取10只肝硬化大鼠和10只正常大鼠肝組織冰凍切片,用免疫組化DAB染色,每張切片隨機選10個視野在400倍光鏡下攝片,通過圖像分析

4、系統(tǒng)測定eNOS表達量(排除血管內(nèi)皮細胞eNOS的表達量,以陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比來表示).并在同一視野測定肝竇容積(以肝竇總切面積占總視野面積百分比表示).(2)取30只肝硬化大鼠,分成三組:eNOS治療組組(n=10),Tris對照組(n=10)和空質(zhì)粒對照組(n=10).eNOS治療組大鼠在氯胺酮麻醉后,自門靜脈緩慢注入己配好的脂質(zhì)體-eNOS質(zhì)?；旌弦?ml(其中含eNOS質(zhì)粒12.5μg、脂質(zhì)體35μl,比例約1:3),兩

5、組對照組則分別用同法注入等量Tris緩沖液和脂質(zhì)體一空質(zhì)粒,注射后5天,用半定量RT-PCR、免疫組化和圖像分析系統(tǒng)測定大鼠肝內(nèi)eNOSmRNA、eNOS含量和肝竇容積.結(jié)果:(1)eNOS含量和肝竇容積在正常大鼠組分別為14.78﹪±3.06﹪和9.32﹪±1.05﹪,在肝硬化大鼠分別為3.81﹪±1.09﹪和3.51﹪±0.72﹪.同正常大鼠組相比,肝硬化大鼠肝內(nèi)eNOS含量和肝竇容積均顯著地降低(p<0.01).無論是正常鼠還是肝

6、硬化大鼠,eNOS含量與肝竇容積之間呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r分別為0.676(p<0.05)和0.703(p<0.05).(2)肝硬化大鼠用三種方法處理后5天,治療組eNOSmRNA含量為1.22±0.14U,顯著高于Tris組(0.93±0.11U)和空質(zhì)粒組(0.89±0.12U)(P<0.01).(3)eNOS治療組eNOS含量和肝竇容積分別為19.43﹪±7.37﹪和5.77﹪±1.49﹪,均顯著高于Tris對照組(3.58﹪±

7、0.97﹪和3.74﹪±0.75﹪)和空質(zhì)粒對照組(3.71﹪±1.26﹪和3.50﹪±0.88﹪)(p<0.01);組eNOS含量與肝竇容積均呈顯著正相關(guān),r分別為0.799(p<0.01)、0.748(n<0.05)和0.767(p<0.01).討論:硬化肝內(nèi)eNOS含量與肝竇容積顯著低于正常肝,且兩者之間呈顯著正相關(guān),表明肝硬化大鼠由于肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞損傷,肝內(nèi)eNOS產(chǎn)量減少,NO合成減少,ET-1/NO動態(tài)平衡失調(diào),使HS

8、C和肝竇收縮,肝竇容積縮小,從而引起肝內(nèi)阻力增加和PVP升高.eNOS基因治療后肝內(nèi)eNOS表達量和肝竇容積顯著增加,表明以脂質(zhì)體為載體經(jīng)門靜脈注射途徑能成功地將eNOS基因?qū)敫斡不笫蟾蝺?nèi),增加肝內(nèi)eNOS表達量并使NO產(chǎn)量增加,肝竇舒張.目的:進一步研究eNS基因治療對肝內(nèi)阻力的影響.方法:(1)腹腔內(nèi)注射CCl<,4>建立肝內(nèi)型肝硬化大鼠模型.取40只肝硬化大鼠隨機分成二組:eNOS治療組(n=16),Tris對照組(n=24)

9、.肝硬化大鼠氯胺酮麻醉后,eNOS治療組自門靜脈緩慢注入已配好的脂質(zhì)體-eNOS質(zhì)粒混合液7ml(其中含eNOS質(zhì)粒12.5μg、脂質(zhì)體35μl,比例約1:3),Tris對照組則注入等量Tris緩沖液.注射5天后,建立肝臟原位灌注模型,eNOS治療組大鼠又分成二亞組:NE組(n=8),在灌流液中加入NE(10<'-8>M—10<'-4>M) ,每三分鐘調(diào)整一次藥物濃度,記錄不同濃度NE時的PVP;NE+L-NMMA組(n=8),灌流液中

10、加入L-NMMA(1010<'-4>M)20分鐘,記錄不同濃度NE時的門靜脈壓力.Tris對照組分成三亞組:NE組(n=8),NE+L-NMMA組(n=8),NE+L-NMMA+L-Arg組(n=8).前兩組灌注方法同前,后一組灌流液中先加入L-Arg(10<'-3>M)10分鐘,然后加入L-NMMA(10<'-4>M)20分鐘,記錄不同濃度NE時的PVP.(2)取24只肝硬化大鼠,治療組(n=12),對照組(n=12),處理方法如同(

11、1)中所述,注射5天后,治療組和對照組又各自分成二亞組即eNOS+L-NMMA(n=6),eNOS+NS(n=6)和Tris+L-NMMA(n=6),Tris+NS(n=6).分別自門靜脈輸注L-NMMA(10μg.kg<'-1>,min<'-1>)或生理鹽水(NS)30分鐘,記錄輸注前后PVP的變化.結(jié)果:(1)當(dāng)加入NOS抑制劑L-NMMA后,顯著增加肝竇和肝內(nèi)門靜脈小分支對NE的反應(yīng),使NE劑量-PVP反應(yīng)曲線左移,PVP最高達到

12、26.7±0.9mmHg,顯著高于單用NE時PVP(22.8±1.4mmHg)(p<0.01).如預(yù)先給予NO合成的底物L(fēng)-Arg,則抵消了L-NMMA升高PVP的作用,PVP最高值降為23.2±0.9mmHg.(2)eNOS基因治療5天后,eNOS治療組肝硬化大鼠在NE最高濃度時PVP為19.9±1.0mmHg顯著低于對照組(22.8±1.4mmHg(p<0.01).灌流液中加入L-NMMA后基因治療組PVP最高值升至23.5±2.0