電穿孔介導(dǎo)的可調(diào)控人胰島素基因肌肉轉(zhuǎn)染對糖尿病小鼠的降糖作用.pdf

1、目的:通過導(dǎo)入外源胰島素基因以補(bǔ)充體內(nèi)胰島素的不足,是經(jīng)典的糖尿病基因治療思路.成功的基因治療有賴于體內(nèi)治療基因長期、有效、可調(diào)控的表達(dá).目前,電穿孔(Electroporation,EP)作為一種有前途的體內(nèi)基因?qū)胧侄?既避免了病毒載體安全性的擔(dān)憂,又克服了裸質(zhì)粒單純注射轉(zhuǎn)染率較低的缺點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)胰島素基因長期有效的表達(dá).但持續(xù)的胰島素表達(dá)勢必會(huì)有低血糖的危險(xiǎn).所以,胰島素基因的調(diào)控,即使其表達(dá)隨血糖變化這一生理需要是基因治療的關(guān)鍵

2、問題.四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用而且安全有效的調(diào)控方法.通過給藥/撤除四環(huán)素或其衍生物可啟動(dòng)/關(guān)閉目的基因的表達(dá).已有應(yīng)用于胰島素基因調(diào)控的試驗(yàn)報(bào)道.在該實(shí)驗(yàn)的前期研究中發(fā)現(xiàn)Balb/C糖尿病小鼠裸質(zhì)粒單純肌肉注射后,血糖降低僅維持約2周.而在昆明種糖尿病小鼠的嘗試中發(fā)現(xiàn),一次單純肌肉注射可以實(shí)現(xiàn)約7周的血糖控制.且兩種系糖尿病小鼠的胰島素表達(dá)均可實(shí)現(xiàn)四環(huán)素系統(tǒng)的體內(nèi)調(diào)控.基于以上的前期探索,利用電穿孔可以增強(qiáng)外源基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移效率,

3、該實(shí)驗(yàn)采用電穿孔介導(dǎo)含有人胰島素基因的目的質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS轉(zhuǎn)染昆明種糖尿病小鼠的肌肉組織,旨在探討電穿孔增強(qiáng)的質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS基因治療的可行性與安全性.方法:1.利用大腸桿菌大量擴(kuò)增、提取并純化該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的可被骨骼肌細(xì)胞Furin蛋白酶酶切成熟的胰島素原表達(dá)質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS.2.以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)昆明小鼠成糖尿病模型.3.成模小鼠分為三組:①EP-ptetINS組(42只)

4、:為強(qiáng)力霉素調(diào)控的目的質(zhì)粒INS(prTA-tet4-rhINS)電穿孔組,該組每只小鼠每側(cè)后腿股部股肉注射目的質(zhì)粒INS150μg,每只小鼠共注射質(zhì)粒300μg;注射后5分鐘內(nèi),在注射部位兩側(cè)與注射方向平行插入兩根電極針,并將其與轉(zhuǎn)基因儀連接,給予方波電脈沖刺激(電壓200V/cm,波寬40ms,脈沖次數(shù)6次,頻率1Hz);②EP-pLNCX組(35只):為不含INS基因的空質(zhì)粒pLNCX電穿孔對照組,與上組轉(zhuǎn)染方法相同,但轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為

5、空質(zhì)粒pLNCX;③Nake-ptetINS組(48只):為強(qiáng)力霉素調(diào)控的目的質(zhì)粒INS(prTA-tet4-rhINS)單純肌肉注射組.該組小鼠每側(cè)后腿股部注射目的質(zhì)粒INS150μg,每只小鼠共注射質(zhì)粒300μg,注射后不予電穿孔.各組轉(zhuǎn)染后立即予飲濃度為2mg/ml強(qiáng)力霉素(Doxycycline,Dox)水.4.每日上午8點(diǎn)葡萄糖氧化酶試紙法檢測鼠尾末梢血糖并秤量各組小鼠體重;ELISA檢測小鼠血清真胰島素;RT-PCR方法證實(shí)

6、人胰島素原基因在小鼠肌肉組織中mRNA水平上的表達(dá);5.通過Dox給藥/撤除以評價(jià)四環(huán)素系統(tǒng)調(diào)控人胰島素表達(dá)的可行性.結(jié)論:1.強(qiáng)力霉素調(diào)控的人胰島素基因可以成功地轉(zhuǎn)染糖尿病小鼠肌肉組織,實(shí)現(xiàn)較為持久的降糖作用,同時(shí)尿量減少,體重穩(wěn)定增加,降低了因STZ毒性所致的糖尿病小鼠較高的死亡率.2.電穿孔介導(dǎo)的質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS轉(zhuǎn)染較裸質(zhì)粒單純注射轉(zhuǎn)染率更高,基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間更長,表達(dá)水平更高,表達(dá)失效后重復(fù)轉(zhuǎn)染同樣有效,且個(gè)體