經動脈灌注LV-mIL12轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣對在體乳腺癌SHZ-88細胞生長影響的研究.pdf

1、基因治療作為一種前沿的治療手段在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，而靶向基因治療由于其良好的、有效的定向治療作用，極低的全身反應，成為目前基因治療研究的熱點。皮瓣是整形外科的常用工具，在難愈性創(chuàng)面及體表腫瘤切除后的修復重建過程中發(fā)揮重要作用。通過對皮瓣進行基因修飾，使其在腫瘤創(chuàng)面修復中兼具抗腫瘤作用，是整形外科領域的進一步拓展。目前應用皮瓣的靶向基因治療在整形外科領域的研究剛剛起步，相關文獻報道較少。本課題在大鼠帶蒂腹壁淺動脈皮瓣(Superfi

2、cialinferiorepigastricarteryflap，SIEAflap)模型的基礎上，深入探討慢病毒載體(Lentivirus，LV)介導外源基因增強型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)經動脈介入灌注轉染復合組織瓣的可行性、安全性并對其轉染條件作出評價，并首次將抗腫瘤因子白介素12與慢病毒載體結合，經動脈灌注于皮瓣中，轉移于局部腫瘤創(chuàng)面，觀察其抗腫瘤效果。本課題由以下四個

3、部分組成：
　　 1、大鼠帶蒂SIEA皮瓣經動脈灌注模型的制備
　　 根據我們的前期研究結果，通過灌注美蘭對大鼠SIEA皮瓣血供系統進行進一步確認、研究，設計完善的手術步驟。設計大鼠帶蒂SIEA島狀皮瓣，通過暫時夾閉其它分支血供，形成一封閉回路，并經SIEA灌注PBS觀察對皮瓣存活的影響。結果顯示，當皮瓣缺血時間在120min時，經此操作灌注PBS術后SIEA皮瓣愈合正常，光鏡下檢測中性粒細胞計數與對照組相比無顯著差異(

4、P＞0.05)。
　　 2、慢病毒載體介導示蹤基因EGFP(LV-EGFP)經動脈灌注轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的研究
　　 體外轉染皮瓣中的主要成分細胞：大鼠主動脈內皮細胞(Rataorticendothelialcell，RAEC)、大鼠的皮膚成纖維細胞(Ratdermalfibroblast，RDF)、人的皮膚成纖維細胞(Humandermalfibroblast，HDF)、人臍靜脈內皮細胞(Hurmanumbili

5、calveinendothelialcell，HUVEC)，觀察不同時間、不同感染復數(Multiplicityofinfection，MOI)下的轉染效率和基因表達水平，尋找最佳轉染復數及轉染時間。結果顯示，對于HDF、HUVEC，LV-EGFP在MOI=50即可有50％以上感染率，在MOI=200時感染率可達到80%以上。對于RDF和RAEC，在MOI=200時可有70%感染率。因此，在MOI=200時對所有的細胞均具有較高的感染率

6、，且不影響細胞活力。對于HDF和HUVEC，在MOI=200時感染2h即可達到滿意效果。對于RDF和RAEC感染時間越長越好（12h之內），感染2h基本可以保證感染率在50%以上。
　　 慢病毒介導EGFP經動脈灌注轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的研究：實驗大鼠依據不同灌注液：LV-EGFP(1.0×108TU/ml、5.0×108TU/ml、1.0×109TU/ml)、PBS，隨機分為4組。按第一部分所訴，經動脈灌注轉染大鼠帶蒂SI

7、EA皮瓣120min。術后第7、14、21、28、40天對外源基因在各組SD大鼠帶蒂SIEA皮瓣的表達和分布情況進行評價。結果顯示：PBS（A組）和LV-EGFP1.0×108TU/ml（B組）、LV-EGFP5.0×108TU/ml（C組）不能有效轉染皮瓣。1.0×109TU/ml（D組）可以有效轉染皮瓣，在術后40天仍有表達，對肝、腎無影響。
　　 3、目的基因mIL12(murineInterleukin-12，mIL12

8、)過表達慢病毒載體構建及功能檢測
　　 選取具有抗腫瘤作用的IL12作為目的基因，以pORF-mIL-12為模板，PCR調取目的基因，與表達載體重組，采用三質粒慢病毒包裝系統構建重組白介素12慢病毒(LV-mIL-12)。以構建好的LV-mIL-12感染人及大鼠皮膚成纖維細胞(HDF、RDF)、血管內皮細胞(HUVEC、RAEC)，檢測mIL-12過表達及生物活性。結果顯示：成功構建了白介素12重組慢病毒包裝質粒，能在細胞內表達

9、。LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要幾種細胞，并分泌有生物活性的mIL-12。
　　 4、LV-mIL12經動脈灌注轉染大鼠帶蒂的SIEA皮瓣對大鼠SH2-88乳腺癌細胞的影響
　　 行大鼠SH2-88乳腺癌細胞皮瓣皮下接種法建立大鼠乳腺癌模型，將SD大鼠經動脈灌注液不同：LV-mIL12、LV-EGFP、PBS隨機分為三組。按前文所述制備SIEA島狀皮瓣，經動脈灌注不同灌注液，分別于術后的第1～40天，觀察負瘤鼠

10、生長情況、SIEA皮瓣成活情況及局部瘤體生長情況。結果顯示：在術后的28天，ELISA檢測實驗組皮瓣中央及皮瓣周圍均有mIL12表達，皮瓣中央處表達量＞皮瓣周圍＞對照組。經動脈灌注LV-mIL12轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣在早期（7～15天）抑制了局部腫瘤細胞的生長。但到第20天后腫瘤生長實驗組與對照組基本持平，腫瘤體積不再明顯長大。
　　 綜上所述，本實驗建立了操作簡便、穩(wěn)定的大鼠帶蒂SIEA皮瓣經動脈灌注研究模型。證實慢病毒載