杭白菊總黃酮對大鼠缺血-再灌損傷大腦的保護作用.pdf

1、背景：病率及致殘率很高，并有調(diào)查結(jié)果顯示，我國35歲以上人群中80％以上具有不同程度的腦中風(fēng)潛伏癥狀。盡管組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator)、尿激酶原(prourokinase)、低分子量肝素(low-molecular-weightheparin)、蛇毒抗凝酶(ancrod)等溶解血栓的藥物能明顯改善急性缺血性中風(fēng)病人的臨床癥狀，但因這類藥物是通過溶解血栓或防止血管內(nèi)進(jìn)一步形成血栓來“拯救

2、”已發(fā)生缺血應(yīng)激的神經(jīng)細(xì)胞，而不能保護缺血下的神經(jīng)細(xì)胞，使之在臨床上的應(yīng)用受到局限。 類黃酮(flavonoids)是人們?nèi)粘ｏ嬍车囊徊糠郑绹似骄刻齑蟾乓獢z入lg左右的類黃酮混合物。類黃酮廣泛存在于多種水果、蔬菜、堅果、種子、藥草、香料、莖、花、茶葉以及紅酒中。它們是由帶有不同取代基的三環(huán)結(jié)構(gòu)組成的低分子量化合物。近幾十年來隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，人們越來越關(guān)注植物中類黃酮的研究及應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)類黃酮具有抗炎、抗氧化、抗過敏

3、、保肝、抗血栓、抗病毒及抗癌等生物學(xué)活性。 近年來發(fā)現(xiàn)，植物總黃酮如銀杏葉總黃酮、山楂葉總黃酮等對缺氧或缺血腦組織具有保護作用，可對抗缺血引起的腦細(xì)胞凋亡。Choi等在神經(jīng)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)黃芩總黃酮具有抗凋亡及抗蛋白質(zhì)氧化的作用。杭白菊富含類黃酮物質(zhì)，主要類黃酮有木樨草素、芹菜素、金合歡素等。我們前期的工作證明，杭白菊提取液對肝微粒體、腦線粒體、心肌線粒體自發(fā)生成或由羥自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化均有很強的抑制作用，可以抑制缺血時心肌組織脂

4、質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的升高和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性的降低。然而有關(guān)杭白菊總黃酮(totalflavonesextractedfromchrysanthemummorifolium，TFCM)對腦缺血/再灌損傷的作用，目前尚無報道。 目的：本實驗采用大鼠大腦中動脈梗塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型

5、，研究TFCM對大鼠腦梗死面積、腦水腫、神經(jīng)癥狀評分、腦組織SOD活性、MDA含量、氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)生成及線粒體功能的作用及相關(guān)機制。 方法1.MCAO模型的建立采用大腦中動脈內(nèi)栓線梗塞法建立MCAO模型。缺血90min，再灌22h。 2.神經(jīng)癥狀評分及大腦梗死面積、腦水腫的測定再灌后，按“10分法”進(jìn)行神經(jīng)癥狀評分，然后立即斷頭取腦，去除小腦及腦干，將大腦沿冠狀面切成2mm

6、厚的腦片，于2％TTC溶液中染色，并在10％甲醛溶液中固定24h后，用ImageJ(美國NIH)分析軟件計算梗死面積與全腦面積之比。腦水腫用缺血半腦面積相對于對側(cè)半腦面積增加的百分比來表示。 3.腦組織SOD活性及MDA含量的測定制備腦組織勻漿樣本，分別采用黃嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸(TBA)法，測定樣本中的SOD活性及MDA含量。 4.ROS的測定制備腦組織勻漿樣本，用熒光分光光度計檢測樣本中的ROS含量，以H2DC

7、FDA(2’，7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate)為熒光探針。H2DCFDA脫乙酰基成為H2DCF(dichlorodihydrofluorescein)，H2DCF再被ROS氧化生成DCF(dichlorofluorescein)，分別在488nm和525nm的激發(fā)波長及發(fā)散波長下檢測DCF的熒光強度。DCF發(fā)出的熒光強度表示ROS含量的多少。 5.大腦線粒體的提取參照Kosenko等

8、的方法提取腦線粒體。6.線粒體腫脹的測定用Ca2+誘導(dǎo)腦線粒體腫脹，UV-4802型分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)連續(xù)測定線粒體混懸液在540nm處吸光度值的變化，測定時間為8min。 7.腦脊液及血漿中TFCM各成分含量的測定分別制備大鼠腦脊液及血漿樣本，用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)(流動相為甲醇：0.2％磷酸水溶液=55：45，V/V)定性分析樣本中

9、的TFCM主要成分含量。 結(jié)果：1.TFCM對腦缺血/再灌后神經(jīng)癥狀的影響相對于模型組，TFCM(50，100，200mg/kg，ip)預(yù)處理組神經(jīng)癥狀評分明顯降低，并呈濃度依賴性。 2.TFCM對腦梗死面積的影響與模型組相比，經(jīng)TFCM(50，100，200mg/kg，ip)預(yù)處理的大鼠腦缺血/再灌后，其腦梗死面積與全腦面積之比分別減小30.18％，45.78％和53.24％。TFCM減小梗死面積的作用呈濃度依賴性。

10、 3.TFCM對腦水腫面積的影響與模型組相比，經(jīng)TFCM(50，100，200mg/kg，ip)預(yù)處理的大鼠腦缺血/再灌后，其缺血半腦面積相對于對側(cè)半腦面積增加的百分比分別減小27.85％，34.27％和42.58％。 4.TFCM對腦組織MDA含量及SOD活性的影響與模型組相比，TFCM(50，100，200mg/kg，ip)均能明顯抑制缺血腦組織MDA含量的升高及SOD活性的降低。 5.TFCM對缺氧腦組織RO

11、S生成的影響100mg/kgTFCM預(yù)處理組缺氧腦組織的DCF熒光強度明顯低于缺氧組。6.TFCM對Ca2+誘導(dǎo)腦線粒體腫脹的影響與單純加Ca2+組相比，TFCM預(yù)處理組線粒體腫脹程度明顯減輕，蒼術(shù)苷(atractyloside,Atr)可對抗TFCM減輕線粒體腫脹的作用。 7.腦脊液及血漿中TFCM各成分含量的定性分析腦脊液中能檢測到木樨草素及芹菜素兩種類黃酮，且芹菜素含量明顯高于木樨草素，但兩者含量均明顯低于血漿中的含量。