遺傳性包涵體肌病非折疊蛋白反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)分析.pdf

1、目的： 遺傳性包涵體肌病(HIBM)是1993年Askanas等建議對(duì)一組以細(xì)胞核和胞漿內(nèi)管絲狀包涵體為特征性病理改變的遺傳性骨骼肌疾病使用的病理學(xué)術(shù)語(yǔ)。近年相繼發(fā)現(xiàn)許多具有隱性和顯性遺傳特點(diǎn)的包涵體肌病，臨床表現(xiàn)各不相同，其基因和蛋白性質(zhì)也逐漸被闡明。遺傳性包涵體肌病常染色體隱性遺傳型包括GNE病和眼咽型遠(yuǎn)端肌?。怀Ｈ旧w顯性遺傳型包括Welander遠(yuǎn)端肌病，肌球蛋白重鏈Ⅱα病，Titin病和Valosin病。其中GNE病是

2、遺傳型包涵體肌病的原型，包括了中東猶太人的股四頭肌不受累的空泡肌病(VMSQ)和日本人的伴鑲邊空泡的遠(yuǎn)端肌病(DMRV)兩種臨床類型，屬于常染色體隱性遺傳神經(jīng)肌肉病，以成年早期起病的下肢遠(yuǎn)端前部肌肉肌無(wú)力和萎縮為特征，股四頭肌相對(duì)不受累。疾病由定位于9p13.2的UDP(尿苷二磷酸)-N-乙酰葡糖胺-2-表異位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶基因錯(cuò)義突變導(dǎo)致。UDP(尿苷二磷酸)-N-乙酰葡糖胺-2-表異位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶是廣泛表達(dá)的在

3、唾液酸生物合成起關(guān)鍵作用的雙功能限速酶。遺傳性包涵體肌病相關(guān)的GNE基因突變導(dǎo)致兩種酶功能活性的減低，很可能導(dǎo)致了唾液酸代謝紊亂最終導(dǎo)致肌纖維的退行性改變。其確切的發(fā)病機(jī)制還不明確。本研究選取了8例臨床和肌肉活檢病理診斷為遺傳性包涵體肌病的患者，采用組織免疫熒光染色和免疫印跡的方法檢測(cè)患者肌纖維內(nèi)異常蛋白的聚集、分布和性質(zhì)及部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白的表達(dá)變化，探討遺傳性包涵體肌病的發(fā)病機(jī)理。 材料和方法： 選取山東大學(xué)齊魯

4、醫(yī)院神經(jīng)肌肉病研究室接診的8例臨床和肌肉活檢病理診斷為遺傳性包涵體肌病患者的肌肉標(biāo)本，其中男2例，女6例。另選病理報(bào)告為正常的肌肉標(biāo)本2例做為對(duì)照。經(jīng)液氮預(yù)冷的異戊烷中速凍的冰凍肌肉標(biāo)本制成4μm冰凍切片，用抗β淀粉樣蛋白前體蛋白(β-APP)，磷酸化tau蛋白(P-tau)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)，鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性蛋白72(ERp72)的5種抗體做組織免疫熒光染色(IF），對(duì)6例患者的冰凍

5、肌肉標(biāo)本，提取肌肉組織總蛋白對(duì)上述5種蛋白行免疫印跡分析(WB)。 結(jié)果： IF與WB分析結(jié)果：免疫熒光染色證實(shí)HIBM患者部分肌纖維內(nèi)存在不同程度的p淀粉樣蛋白前體蛋白(β-APP)和磷酸化tau蛋白(P-tau)的聚集，β-APP蛋白聚集形態(tài)多數(shù)呈網(wǎng)格斑片狀分布，以萎縮的小纖維內(nèi)多見；部分呈接近肌纖維直徑大小的類圓形，見于正常大小肌纖維內(nèi)。P-tau蛋白聚集形態(tài)呈網(wǎng)格斑片狀分布，見于萎縮的小纖維內(nèi)。β-APP和P-t

6、au聚集在鑲邊空泡以外的部位。肌外膜和肌束膜呈非特異性染色。正常對(duì)照肌肉標(biāo)本中僅見肌外膜和肌束膜非特異性染色，肌纖維內(nèi)未見β-APP和P-tau表達(dá)。HIBM患者部分肌纖維內(nèi)可見GRP94和calreticulin表達(dá)，位于萎縮小纖維內(nèi)呈彌漫性分布。正常對(duì)照肌纖維內(nèi)未見GRP94和calreticulin表達(dá)。免疫熒光雙重染色見β-APP聚集和分子伴侶蛋白GRP94呈共表達(dá)現(xiàn)象，在β-APP聚集部位可見GRP94的表達(dá)。HIBM患者分子

7、伴侶ERp72在肌纖維內(nèi)分布于鑲邊空泡以外區(qū)域，鑲邊空泡周邊呈環(huán)形強(qiáng)免疫熒光染色。正常對(duì)照肌肉標(biāo)本中可見兩型纖維差別免疫熒光染色。 對(duì)8例遺傳性包涵體肌病患者的肌肉標(biāo)本，提取肌肉組織總蛋白并測(cè)定提取液蛋白濃度后，進(jìn)一步作WB分析，定量檢測(cè)上述5種蛋白。3例行β-APP免疫印跡分析結(jié)果顯示遺傳性包涵體肌病患者肌纖維與正常對(duì)照標(biāo)本相比β-APP含量增高有意義(>30％)。7例行P-tau免疫印跡分析，5例較正常增高有意義，1例增高不

8、明顯，1例含量較正常對(duì)照減低。3例行GRP94免疫印跡分析均較正常對(duì)照含量增高有意義。4例行ERp72免疫印跡分析，3例較正常對(duì)照增高有意義，1例較對(duì)照增高不明顯；4例行calreticulin免疫印跡分析，2例均較正常對(duì)照增高有意義，2例增高不明顯。 結(jié)論： 1.HIBM患者在小的變性萎縮肌纖維內(nèi)見網(wǎng)格斑片狀β-APP和P-tau蛋白的聚集，提示細(xì)胞內(nèi)過(guò)量異常折疊蛋白的聚集可能是導(dǎo)致肌纖維退行性變的原因。正?；鹦〖±w維

9、內(nèi)類圓形β-APP表達(dá)可能為異常蛋白聚集初期的形態(tài)表現(xiàn)。 2.小的萎縮肌纖維內(nèi)分子伴侶蛋白GRP94、ERp72和calreticulin的強(qiáng)免疫熒光染色提示萎縮肌纖維可能存在異常蛋白導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和分子伴侶表達(dá)上調(diào)。免疫熒光雙重染色可見肌纖維內(nèi)β-APP蛋白聚集部位存在分子伴侶蛋白GRP94的表達(dá)，表明GRP94蛋白在β-APP聚集引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中起作用。 3.本研究在對(duì)異常聚集蛋白和分子伴侶蛋白的免疫學(xué)檢