異丙酚預(yù)先給藥對(duì)HepG2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)是真核細(xì)胞中由膜圍成的隧道系統(tǒng),是一種重要的細(xì)胞器,其基本生理功能包括蛋白質(zhì)的合成、修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)以及Ca2+濃度的調(diào)節(jié)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡高度敏感,肝細(xì)胞缺氧復(fù)氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭、大量氧自由基的產(chǎn)生和鈣離子平衡紊亂,可導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積于內(nèi)置網(wǎng),引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress,ERS)。
　　ERS是細(xì)胞一種

2、自我保護(hù)機(jī)制,細(xì)胞為適應(yīng)外界的不良刺激,維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),相繼活化一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力,加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解,減少新生蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)。持續(xù)或者過(guò)強(qiáng)的ERS使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)不能重建,引起細(xì)胞自噬和凋亡造成細(xì)胞損傷。ERS途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是不同于死亡受體途徑和線粒體途徑的第3種細(xì)胞凋亡途徑。ERS可通過(guò)C/EBP同源蛋白(CHOP)、C-JUN氨基末端激酶(JNKs)和Caspase-12途徑導(dǎo)致細(xì)胞的凋

3、亡。
　　異丙酚(Propofol)是一種非巴比妥類靜脈麻醉藥,因其起效快,蘇醒迅速而完全,持續(xù)輸注后不易蓄積,目前普遍用于麻醉誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜及麻醉維持。研究表明,肝臟缺血前給予異丙酚,可提高其對(duì)肝損傷的耐受能力,減輕肝臟缺血再灌注損傷。但其具體機(jī)制尚不清楚,可能與其抗氧化、清除氧自由基和上調(diào)血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)的活力等有關(guān)。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)異丙酚預(yù)先給藥對(duì)HEPG2細(xì)胞

4、缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,探討其減輕HEPG2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的機(jī)制,為指導(dǎo)臨床麻醉用藥提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、采用物理缺氧復(fù)氧的方法制備HEPG2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型,模擬臨床的肝臟缺血再灌注損傷模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將HEPG2細(xì)胞隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(control組)、缺氧6h復(fù)氧12h(H6/R12)組、缺氧12h復(fù)氧12h(H12/R12)組、缺氧24h復(fù)氧12h(H24/R12)組和缺氧48

5、h復(fù)氧12h(H48/R12)組。采用MTT比色法檢測(cè)HEPG2細(xì)胞的相對(duì)增值情況,OD值下降40％作為缺氧復(fù)氧模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、明確異丙酚減輕細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的最適藥物濃度,采用隨機(jī)數(shù)字表法,將HEPG2細(xì)胞隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組(control組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)和缺氧復(fù)氧+異丙酚(5μmol)組(H/R+PPF5組)、缺氧復(fù)氧+異丙酚(10μmol)組(H/R+PPF10組)、缺氧復(fù)氧+異丙酚(20μm

6、ol)組(H/R+PPF20組)和缺氧復(fù)氧+異丙酚(40μmol)組(H/R+PPF40組)。采用MTT比色法檢測(cè)HEPG2細(xì)胞的相對(duì)增值率,10μmol異丙酚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　3、采用隨機(jī)數(shù)字表法將HEPG2細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(control組)、異丙酚10μmol組(PPF組)、缺氧24 h復(fù)氧12h(H/R)組和缺氧24 h復(fù)氧12h+異丙酚10μmol組(H/R+PPF組)。采用Western blotin

7、g(WB)方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白:免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子(eIF2α)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)和凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3的表達(dá);采用RT-PCR的方法檢測(cè)BIP mRNA、CHOP mRNA、和Caspase-3mRNA的表達(dá)。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)

8、準(zhǔn)差(xs)表示,單因素方差分析用于不同組間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.缺氧復(fù)氧對(duì)HEPG2細(xì)胞活力的影響
　　與control組比較,H24/R12組細(xì)胞增值率下降(P<0.05),由0.686±0.045下降至0.404±0.033,下降約40%。
　　2.不同濃度異丙酚對(duì)缺氧復(fù)氧(H/R)損傷HepG2細(xì)胞相對(duì)增值率的影響
　　MTT比色法結(jié)果顯示:與control組比

9、較,H/R組和H/R+PPF組細(xì)胞OD值下降,細(xì)胞相對(duì)增值率下降(P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細(xì)胞OD值由0.303±0.030增加至0.505±0.079,細(xì)胞相對(duì)增值率增加最為顯著。
　　3.異丙酚(10μmol/L)對(duì)H/R損傷HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3表達(dá)的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3表達(dá)顯著上

10、調(diào)(*P<0.05);與 H/R組比較,H/R+PPF10組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　4.異丙酚(10μmol/L)對(duì)H/R損傷HepG2細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細(xì)胞Caspase-3 mRNA的

11、表達(dá)顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　5.異丙酚(10μmol/L)對(duì)H/R損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和CHOP表達(dá)的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和CHOP的表達(dá)顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細(xì)胞的BIP和CHOP表達(dá)顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　6.異丙酚(10μmol/L)對(duì)H/R損傷HepG2細(xì)胞

12、BIP mRNA和CHOP mRNA表達(dá)的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細(xì)胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細(xì)胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　7.異丙酚(10μmol/L)對(duì)H/R損傷HepG2細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4表達(dá)的影響
　　與control

13、組相比,H/R組和H/R+PPF10組細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達(dá)顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達(dá)顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.異丙酚預(yù)先給藥可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕HEPG2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷;
　　2.異丙酚預(yù)先給藥可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕細(xì)胞凋亡;
　　3.異丙酚抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的作用主要是