D-半乳糖致衰老小鼠腦內(nèi)mGluR1α與GLT的變化.pdf

1、D-半乳糖是一種生理性營養(yǎng)成分,在正常機(jī)體代謝中可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?參與葡萄糖代謝,但過量供給會導(dǎo)致代謝紊亂。在一定時(shí)間內(nèi),連續(xù)給動物注射大劑量D-半乳糖,引起與自然衰老相似的生化改變、免疫功能低下、基因表達(dá)與調(diào)控異常、細(xì)胞生長繁殖能力下降、細(xì)胞退行性改變及認(rèn)知障礙等表現(xiàn)。D-半乳糖衰老模型在一定程度上較好地模擬了自然衰老的改變,因此被廣泛應(yīng)用于衰老、腦老化和相關(guān)藥物篩查的研究領(lǐng)域。目前,由D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型已逐漸用于衰老機(jī)制、老年病

2、及抗衰老藥物篩選等方面的研究。
　　 谷氨酸(glutamate,Glu)作為組成人體生化代謝的氨基酸之一,在腦中參與蛋白質(zhì)、多肽以及脂肪酸的合成,也參與三羧酸循環(huán),同時(shí)也是腦內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中含量最高的一種氨基酸,主要存在于大腦皮質(zhì)、海馬、小腦、紋狀體;mGluR1α屬于第一組代謝型谷氨酸受體(metabotropic gluatamate receptor,mGluR),位于突觸后膜上,在腦

3、內(nèi)分布廣泛,其中大腦皮質(zhì)和海馬的受體密度最高,間腦和中腦等部位則較低。被激活后參與快速的興奮性突觸傳遞,調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸的可塑性、突觸長時(shí)程增強(qiáng)和長時(shí)程抑制以及學(xué)習(xí)和記憶等中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能,可增強(qiáng)離子型谷氨酸受體(ionotropicgluatamate receptor,iGluR)介導(dǎo)的興奮性毒性;GLT(EAAT2)為五種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate ransporter,EAAT)中的一種,是一種載體蛋白,

4、位于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的胞膜上,主要表達(dá)于前腦、海馬、大腦皮層和紋狀體等部位,參與谷氨酸重?cái)z取、控制胞外谷氨酸濃度。防止興奮毒性主要是由GLT-1和GLAST(EAAT1)完成。
　　 衰老和腦老化模型是研究衰老和腦老化的表現(xiàn)、機(jī)制以及篩選延緩衰老藥物的重要手段,也是目前老年醫(yī)學(xué)亟待解決的問題。研究表明D-半乳糖擬衰老模型在大鼠和小鼠等實(shí)驗(yàn)動物上都表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的病理生理改變,表現(xiàn)有生化指標(biāo)異常,免疫功能降低,基因調(diào)

5、控與表達(dá)異常,細(xì)胞生長繁殖能力下降及細(xì)胞退行性變,大鼠操作性記憶鞏固與再現(xiàn)障礙等。但是對該模型致衰老的機(jī)理研究各家說法不一,有學(xué)者認(rèn)為是D-半乳糖醇中毒所致,另一部分學(xué)者則認(rèn)為D-半乳糖在代謝過程中誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧應(yīng)激態(tài),超載的自由基是其致衰老的主要原因。
　　 黑質(zhì).紋狀體系統(tǒng)中主要是多巴胺能神經(jīng)元,多巴胺(dopamine,DA)是錐體外系的重要遞質(zhì),因此它與軀體運(yùn)動有密切關(guān)系。加強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)元的活動導(dǎo)致運(yùn)動功能增強(qiáng)。相反,

6、削弱多巴胺能神經(jīng)元活動使運(yùn)動功能降低。海馬的三突觸回路是海馬長時(shí)程增強(qiáng)電生理效應(yīng)的神經(jīng)基礎(chǔ),而長時(shí)程增強(qiáng)正是記憶產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制。在黑質(zhì)-紋狀體和海馬都有谷氨酸能神經(jīng)元及纖維投射分布。因此,黑質(zhì)-尾殼核和海馬谷氨酸體系的改變,可以導(dǎo)致黑質(zhì)-尾殼核和海馬神經(jīng)元損傷、功能障礙,從而引起模型鼠行為的改變和認(rèn)知的障礙。
　　 目的:本研究利用HE染色、尼氏染色以及免疫組織化學(xué)技術(shù),觀察D-半乳糖處理昆明小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量的變化,以及黑質(zhì)-

7、尾殼核和海馬mGluR1α僅、GLT免疫反應(yīng)強(qiáng)度的變化,探討D-半乳糖處理對昆明小鼠mGluR1α、GLT表達(dá)的影響,從形態(tài)學(xué)水平了解D-半乳糖擬衰老模型的遞質(zhì)受體及轉(zhuǎn)運(yùn)體功能狀況,以探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:選用健康雄性昆明小鼠,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組(D-galactose,D-gal)背部皮下注射D-半乳糖(60mg/Kg/d);對照組(control,Con)小鼠相同部位注射等量生理鹽水。給藥6周后以形

8、態(tài)學(xué)方法檢測小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量變化,以及mGluR1α、GLT在各個(gè)部位的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果:1.黑質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:長期D-半乳糖處理可導(dǎo)致小鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少。在本實(shí)驗(yàn)HE染色和尼氏染色黑質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果中,D-半乳糖處理組為27.78±4.77,對照組為35.28±9.45,D-半乳糖處理組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量明顯低于對照組(P＜0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①mGluR1α

9、免疫組化結(jié)果:長期D-半乳糖處理可增加mGluR1α在中腦黑質(zhì)、尾殼核和海馬的表達(dá)強(qiáng)度。顯微鏡40倍物鏡下觀察,D-半乳糖處理組小鼠在中腦黑質(zhì)和尾殼核mGluR1α陽性纖維免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)。通過靜態(tài)灰度值分析發(fā)現(xiàn):D-半乳糖處理組黑質(zhì)為151.50±8.26,對照組黑質(zhì)為157.23±5.57;D-半乳糖處理組尾殼核為148.51±9.80,對照組尾殼核為154.35±7.70;D-半乳糖處理組海馬腔隙層為155.04±8.05,對照組

10、海馬腔隙層為158.89±7.15;D-半乳糖處理組海馬始層為154.29±6.41,對照組海馬始層為158.89±8.31,D-半乳糖處理組小鼠黑質(zhì)、尾殼核和海馬腔隙層mGluR1α灰度值明顯低于對照組(P＜0.01),海馬始層mGluR1α灰度值低于對照組(P＜0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②GLT免疫組化結(jié)果:長期D-半乳糖處理可降低GLT在中腦黑質(zhì)和海馬的表達(dá)強(qiáng)度。顯微鏡40倍物鏡下觀察,D-半乳糖處理組小鼠在中腦黑質(zhì)GLT陽性纖

11、維免疫反應(yīng)明顯減弱,在尾殼核無明顯變化,但較對照組稀疏。通過靜態(tài)灰度值分析發(fā)現(xiàn):D-半乳糖處理組黑質(zhì)為151.06±5.94,對照組黑質(zhì)為141.03±8.00;D-半乳糖處理組尾殼核為157.46±6.03,對照組尾殼核為157.37±6.14;D-半乳糖處理組海馬錐體層為153.89±7.50,對照組海馬錐體層為151.00±9.17,D-半乳糖處理組小鼠黑質(zhì)GLT灰度值明顯高于對照組(P＜0.01),海馬錐體層GLT灰度值高于對照

12、組(P＜0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D-半乳糖處理組小鼠尾殼核GLT灰度值較對照組無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:1.長期D-半乳糖處理可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)與自然老化類似的神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少;2.長期D-半乳糖處理增加小鼠黑質(zhì)、尾殼核和海馬mGluR1α的含量;3.長期D-半乳糖處理減少小鼠黑質(zhì)和海馬GLT的含量;4.推測長期D-半乳糖處理可能通過擾亂谷氨酸受體功能,減少谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,改變谷氨酸代謝,增強(qiáng)谷