金蕎麥提取物對肥大細(xì)胞介導(dǎo)的腹瀉型腸易激綜合征的作用及其機(jī)制初探.pdf

1、[研究目的與意義]
　　目前諸多研究表明肥大細(xì)胞(MC)及其釋放的相關(guān)介質(zhì)是導(dǎo)致腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此針對MC的治療是中西醫(yī)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。本課題擬:(1)從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證金蕎麥提取物(Fag)對D-IBS模型大鼠胃腸道動力紊亂、內(nèi)臟高敏感性、腸黏膜低度炎癥、腸黏膜屏障受損及MC活化脫顆粒的影響;(2)從體外實(shí)驗(yàn)探討Fag治療抗原誘導(dǎo)的MC活化脫顆粒的分子機(jī)制。從而拓寬了金蕎麥的臨床適應(yīng)癥范圍，為開發(fā)

2、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有可觀的臨床應(yīng)用價(jià)值和市場前景。
　　[研究方法]
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　(1)予新生期母嬰分離聯(lián)合乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射建立D-IBS大鼠模型，通過統(tǒng)計(jì)D-IBS模型大鼠排便顆粒數(shù)、觀察糞便Bristol分級、腹壁回撤反應(yīng)(AWR)、腸黏膜HE染色等方法評價(jià)模型的可靠性。(2)觀察Fag對D-IBS模型大鼠排便顆粒數(shù)、糞便Bristol分級、AWR、腸黏膜HE染色的影響

3、。予免疫組化檢測D-IBS模型大鼠腸黏膜MC數(shù)目及活化脫顆粒程度;予免疫組化、ELISA法檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜類胰蛋白酶(tryptase)水平;予免疫組化、Western blot檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸蛋白酶激活受體2(PAR-2)表達(dá);予ELISA法檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6的表達(dá);予免疫組化、ELISA法檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜P物質(zhì)(SP)表達(dá);予Western blot檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸occludin蛋白表達(dá);觀察Fag對上述指標(biāo)的作用。

4、r>　　2、體外實(shí)驗(yàn)
　　通過抗原誘導(dǎo)大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(RBL-2H3)建立MC活化脫顆粒模型。予MTS法檢測Fag對RBL-2H3細(xì)胞的增殖活性，篩選Fag的安全工作濃度;予底物顯色反應(yīng)檢測RBL-2H3細(xì)胞上清β-Hex釋放;予ELISA檢測細(xì)胞上清tryptase、TNF-α、IL-6水平;予Weaternblot檢測抗原誘導(dǎo)的RBL-2H3活化脫顆粒相關(guān)受體及蛋白FcεRI、p-Lyn、Lyn、p-Syk、Syk、MA

5、PK家族(p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、ERK1/2、JNK、p38)、p-AKT、AKT、p-Plcγ1/2、p-PKCβ的表達(dá)，觀察Fag對上述指標(biāo)的作用。
　　[結(jié)果]
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　(1)模型改良及評價(jià):采用新生期母嬰分離、乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射三法復(fù)制的模型，大鼠表現(xiàn)出皮毛色澤變暗、活動度減少、喜好扎堆等表現(xiàn);排便顆粒數(shù)增加、糞便Bristol分級升高、20、40、60mmHg球囊

6、壓力下AWR評分增高、腸黏膜HE染色存在少量炎性細(xì)胞浸潤。該復(fù)合造模方法可基本復(fù)制D-IBS模型。
　　(2) Fag對D-IBS模型大鼠整體療效評價(jià):①Fag各劑量組對大鼠體重增長率無明顯影響，與酮替芬組療效相當(dāng)。②Fag中、高劑量組可有效減少排便顆粒數(shù)，高劑量組與酮替芬組療效相當(dāng)。③Fag中、高劑量組可有效降低糞便Bristol分級，與酮替芬組均療效相當(dāng)。④20mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag中、高劑量組、酮替芬組可有效降低AWR評

7、分，高劑量組與酮替芬組療效相當(dāng);40mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag中、高劑量組、酮替芬組可有效降低AWR評分，且高劑量組療效優(yōu)于酮替芬組;60mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag高劑量組、酮替芬組可有效降低AWR評分，兩組療效相當(dāng);80 mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag各劑量組、酮替芬組對AWR評分無影響。⑤Fag中、高劑量組、酮替芬組均可降低腸黏膜低度炎癥。
　　(3) Fag對D-IBS模型大鼠MC及其相關(guān)物質(zhì)的作用:①Fag高劑量組、酮替芬組可

8、減少M(fèi)C數(shù)目，高劑量組與酮替芬組療效相當(dāng);Fag中、高劑量組、酮替芬組可抑制MC活化脫顆粒，高劑量與酮替芬組療效相當(dāng)。②Fag中、高劑量組、酮替芬組可降低遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜tryptase表達(dá)，高劑量組與酮替芬組療效相當(dāng)。③Fag中、高劑量組、酮替芬組可顯著降低遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6水平，F(xiàn)ag高劑量組與酮替芬組療效相當(dāng)。④Fag中、高劑量組、酮替芬組可顯著降低遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜上皮PAR-2蛋白表達(dá)，高劑量組與酮替芬組療效相當(dāng)。⑤Fag

9、中、高劑量組、酮替芬組可顯著降低遠(yuǎn)端結(jié)腸SP表達(dá)，且Fag高劑量療效優(yōu)于酮替芬組。⑥Fag中、高劑量組、酮替芬組可顯著提高遠(yuǎn)端結(jié)腸occludin蛋白表達(dá)。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)
　　(1) Fag在3-50μg/ml濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞增殖活性無抑制作用，選擇10、30、50μg/ml濃度范圍作為Fag的安全工作濃度。
　　(2) Fag中、高劑量對抗原誘導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞β-HEX釋放率具有抑制作用。
　　(3)

10、 Fag中、高劑量組可抑制RBL-2H3細(xì)胞tryptase釋放。
　　(4) Fag中、高劑量組可抑制RBL-2H3細(xì)胞TNF-α、IL-6釋放。
　　(5)各濃度Fag對上游蛋白FcεRI、p-Lyn、Lyn、p-Syk、Syk無明顯作用。
　　(6) Fag可抑制p-JNK、p-p38、p-ERK1/2表達(dá)，但具有選擇性，其中Fag中、高劑量組對p-JNK、p-ERK1/2蛋白的作用明顯，F(xiàn)ag高劑量組對p-p3

11、8蛋白作用明顯，各濃度Fag對JNK、p38、ERK1/2表達(dá)均無明顯作用。
　　(7)各濃度Fag對p-AKT、AKT蛋白均無明顯作用。
　　(8)各濃度Fag對p-Plcγ1/2蛋白均無明顯作用，F(xiàn)ag中、高劑量可抑制p-PKCβ蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　(1)新生期母嬰分離聯(lián)合乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射可模擬D-IBS胃腸道動力增高、腸黏膜屏障受損、內(nèi)臟高敏感、腸黏膜低度炎癥等

12、特征。
　　(2) Fag可劑量依賴性地降低D-IBS模型大鼠降低內(nèi)臟高敏感，減輕腸黏膜低度炎癥，緩解胃腸動力亢進(jìn)、改善腸黏膜屏障受損的機(jī)制與抑制D-IBS模型大鼠腸黏膜MC數(shù)量及活化脫顆粒，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及類胰蛋白酶釋放，下調(diào)PAR-2受體，減少SP釋放，上調(diào)occludin蛋白有關(guān)。與酮替芬相比，F(xiàn)ag降低內(nèi)臟痛覺（40mmHg球囊壓力下）的療效優(yōu)于酮替芬，其余各項(xiàng)指標(biāo)兩者療效相當(dāng)。
　　2、細(xì)胞實(shí)