維生素A營(yíng)養(yǎng)對(duì)兒童抗手足口病免疫力的影響.pdf

1、維生素A(vitaminA，VA)是兒童時(shí)期最重要的微量營(yíng)養(yǎng)素之一，能保護(hù)皮膚和粘膜的完整性，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。目前，VA缺乏仍然是影響我國(guó)兒童健康的重要因素之一，可導(dǎo)致兒童病毒感染性疾病的發(fā)病率和死亡率增高。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究已經(jīng)證實(shí):VA能維持免疫細(xì)胞的正常發(fā)育和功能活動(dòng)，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，從而提高機(jī)體的抗感染免疫力。但對(duì)于VA在抗病毒免疫方面的研究還有待深入。近年來(lái)，在我國(guó)部分地區(qū)出現(xiàn)了手足口病(hand，foot and mo

2、uthdisease，HFMD)的爆發(fā)流行，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，主要病原體為腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)。目前尚無(wú)針對(duì)EV71的疫苗或特異性治療藥物，主要依靠機(jī)體的抗病毒免疫力清除病毒，因此研究影響抗病毒免疫力的因素對(duì)于防治HFMD具有重要的臨床意義。HFMD多發(fā)生于5歲以下嬰幼兒，與VA缺乏處于相似的好發(fā)年齡段。另一方面，HFMD的典型病理?yè)p傷出現(xiàn)在皮膚和粘膜，而VA具有維護(hù)皮膚粘膜完整性的作用。因此，我

3、們推測(cè)VA營(yíng)養(yǎng)可能與兒童HFMD之間存在相互影響。鑒于以上原因，本研究將兒童HFMD作為切入點(diǎn)，通過(guò)臨床調(diào)查和體外細(xì)胞培養(yǎng)，探討VA對(duì)兒童抗病毒免疫力的影響及其分子機(jī)制，進(jìn)一步證實(shí)VA營(yíng)養(yǎng)在維護(hù)兒童免疫功能中的重要作用。
　　第一部分維生素A營(yíng)養(yǎng)對(duì)手足口病患兒抗病毒免疫力的影響
　　目的：通過(guò)分析HFMD患兒VA營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)與血清干擾素-α(interferon-α，IFN-α)及EV71-IgM抗體水平的相關(guān)性，探討VA營(yíng)養(yǎng)對(duì)

4、兒童抗病毒免疫力的影響。
　　方法：選取2010年10月至2011年6月我院傳染科收治的450例手足口病患兒為研究對(duì)象，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病診療指南（2010年版）》;同時(shí)選取與患兒年齡和性別一致的113例非感染兒童作為對(duì)照組。1.采用熒光定量PCR法檢測(cè)糞便樣本中腸道病毒EV71;2.采用高效液相色譜法測(cè)定血清VA水平;3.采用24小時(shí)飲食回顧法調(diào)查膳食VA攝入水平，并結(jié)合臨床病情進(jìn)行分析;4.ELISA法測(cè)定血清

5、IFN-α及EV71-IgM抗體水平。
　　結(jié)果：
　　1.450例患兒中，男性303例(67.3％)，女性147例(32.7％)，平均年齡2.5歲，其中226例(50.2％)糞便EV71檢測(cè)呈陽(yáng)性，170例(37.8％)發(fā)生不同程度的并發(fā)癥。
　　2.總體血清VA水平為0.73±0.26μmol/L;其中237例(52.7％)血清VA濃度低于正常水平(0.7μmol/L)。EV71陽(yáng)性的患兒血清VA濃度(0.64±0

6、.24μmol/L)低于EV71陰性患兒(0.825±0.25μmol/L)，P＜0.01。發(fā)生并發(fā)癥的患兒血清VA濃度(0.66±0.23μmol/L)低于未發(fā)生并發(fā)癥的患兒(0.78±0.27μmol/L),P＜0.01。
　　3.92％的患兒每日膳食VA攝入量低于推薦攝入量，其中1～4歲年齡組患兒膳食VA攝入不足情況最嚴(yán)重（297.1±126.1μg視黃醇當(dāng)量/天），僅為推薦攝入量的59.4％。
　　4.與非感染對(duì)照組

7、相比，患兒的血清IFN-α濃度顯著升高，且VA正常組患兒血清IFN-α濃度(112.28(78.38～155.5) pg/mL）顯著高于VA缺乏組患兒(57.29(39.92～85.4) pg/mL），P＜0.01。發(fā)生并發(fā)癥組患兒的血清IFN-α(67.13(46.57～109) pg/mL)濃度低于未發(fā)生并發(fā)癥組(87.7(52.28～130.65) pg/mL)，P＜0.01。值得注意的是:相關(guān)分析結(jié)果顯示:HFMD患兒血清VA水

8、平與IFN-α濃度呈正性相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.58，P＜0.01)。
　　5.VA正常組患兒血清EV71-IgM抗體濃度（32.9±11.8ng/mL）顯著高于VA缺乏組(28.1±9.4ng/m)，P＜0.01。HFMD患兒血清VA水平與EV71-IgM抗體濃度呈正性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.41，P＜0.01）。
　　6.VA缺乏組的患兒并發(fā)癥的發(fā)生率(45.99％)顯著高于VA正常組(28.64％)，P＜0.01。

9、　　結(jié)論：
　　1.HFMD患兒普遍存在膳食VA攝入不足;
　　2.HFMD患兒中VA缺乏癥的發(fā)生率增高，血清VA總體水平降低;
　　3.伴有VA缺乏癥的HFMD患兒中，血清IFN-α和EV71-IgM的濃度降低，且與血清VA水平的降低呈正性相關(guān)關(guān)系;
　　4.在VA缺乏的HFMD患兒中并發(fā)癥的發(fā)生率增高;
　　5.VA營(yíng)養(yǎng)不足可能導(dǎo)致了兒童抗HFMD的免疫力降低。
　　第二部分視黃酸抑制EV71病毒

10、感染的體外研究
　　目的：通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)，證實(shí)VA的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物—全反式視黃酸(all-trans-retinoic acid, atRA)抗EV71病毒感染的作用及其途徑。
　　方法：體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞，分為8組:1.對(duì)照組:無(wú)atRA干預(yù)，無(wú)EV71感染;2.atRA組:給予atRA干預(yù);3.Ro組:加入視黃酸受體α(retinoicacid receptor-α，RAR-α)特異性拮抗劑(Ro41-

11、5253，Ro);4.atRA+Ro組:同時(shí)加入atRA和Ro;5.EV71組:給予EV71感染;6.EV71+atRA組:EV71感染細(xì)胞后加入atRA;7.EV71+Ro組:EV71感染細(xì)胞后加入Ro;8.EV71+atRA+Ro組:EV71感染細(xì)胞后同時(shí)加入atRA和Ro進(jìn)行干預(yù)。分別于干預(yù)后24、48小時(shí)進(jìn)行以下檢測(cè):1.免疫熒光染色法檢測(cè)EV71抗原的表達(dá);2.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)EV71感染細(xì)胞的百分率;3.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)

12、EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率;4.ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α水平;4.熒光定量PCR法檢測(cè)RAR-α，IFNA1和IFN受體IFNAR1 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.EV71可感染體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。干預(yù)后48小時(shí)，與EV71組(45.22±3.68％)相比，EV71+atRA組細(xì)胞EV71感染率(26.52±4.33％)顯著降低，P＜0.01。此外，干預(yù)后24小時(shí)，EV71+atRA組細(xì)胞

13、凋亡率(11.31±1.73％)也低于EV71組(17.64±1.12％)，P＜0.01;
　　2.EV71感染后24小時(shí)，atRA干預(yù)可上調(diào)IFNA1與IFNAR1 mRNA表達(dá);且這種作用在EV71與atRA共同作用時(shí)更加顯著。感染后48小時(shí)，atRA干預(yù)使IFN-α的蛋白水平顯著升高。
　　3.干預(yù)后24小時(shí)，atRA上調(diào)RAR-αmRNA的表達(dá)。與atRA單獨(dú)作用相比，EV71+atRA組RAR-α mRNA的表達(dá)更

14、高;而單獨(dú)的EV71感染對(duì)RAR-αmRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　4.當(dāng)Ro同時(shí)加入時(shí)，atRA的上述作用均被阻抑。
　　結(jié)論：
　　1.atRA能降低EV71對(duì)體外培養(yǎng)U937細(xì)胞的感染率，減少EV71感染造成的細(xì)胞凋亡，具有體外抑制EV71病毒的作用;
　　2.atRA可上調(diào)EV71感染細(xì)胞IFN-α mRNA和蛋白的表達(dá);
　　3.atRA體外抑制EV71病毒的作用主要是通過(guò)RAR-α介導(dǎo)的。

15、>　　第三部分視黃酸對(duì)EV71誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答RIG-Ⅰ通路的調(diào)節(jié)作用
　　目的：研究atRA對(duì)抗EV71病毒免疫應(yīng)答視黃酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(retinoic acidinduced gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ)通路的影響，探討atRA發(fā)揮抗病毒作用的分子機(jī)制，為更深入的臨床研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：分離EV71感染患兒與非感染對(duì)照兒童的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cells，

16、PBMC)。體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞，給予EV71和/或atRA干預(yù)。分別抽提這兩種細(xì)胞的RNA，采用PCR array的方法，檢測(cè)與抗病毒免疫相關(guān)的84個(gè)主要基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過(guò)對(duì)EV71感染的HFMD患兒 PBMC的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，與非感染對(duì)照組相比，EV71感染組有50個(gè)基因的表達(dá)變化超過(guò)了2倍，其中27個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，23個(gè)表達(dá)下調(diào)。EV71感染可下調(diào)RIG-Ⅰ抗病毒通路中病毒識(shí)別受體RIG-Ⅰ，接頭蛋白I