TJU103和CTLA4-Ig對DLI誘導(dǎo)的小鼠cGVHD和GVL效應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　 本研究旨在探討TJU103和CTLA4-Ig阻斷CD4-T細(xì)胞活化的雙信號(hào)系統(tǒng)，對供者淋巴細(xì)胞輸注誘導(dǎo)的慢性GVHD和GVL效應(yīng)的影響，為臨床預(yù)防和治療慢性GVHD探索新的思路。
　　 方法：
　　 1.建立MHC單倍體相合供者淋巴細(xì)胞輸注誘導(dǎo)的小鼠慢性GVHD動(dòng)物模型。
　　 2.體內(nèi)觀察阻斷CD4+T細(xì)胞活化的雙信號(hào)系統(tǒng)對小鼠慢性GVHD的影響。
　　 3.體內(nèi)觀察阻斷

2、CD4+T細(xì)胞活化的雙信號(hào)系統(tǒng)對GVL效應(yīng)的影響。
　　 4.用單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)方法體外動(dòng)態(tài)監(jiān)測各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞刺激宿主T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)、對MHC單倍體相合移植物的殺傷效應(yīng)和對紅白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)的影響。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以小鼠的病理損害，判定小鼠是否發(fā)病，對各臨床觀察指標(biāo)進(jìn)行二分類Logistic回歸危險(xiǎn)度分析；以Kaplan生存曲

3、線描述各組小鼠的慢性GVHD的患病率并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；以H檢驗(yàn)比較各組小鼠GVHD的嚴(yán)重程度，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行慢性GVHD的重復(fù)性檢驗(yàn)；析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較各組35天和85天混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的增殖率和反應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率的差異；單因素方差分析比較各組小鼠負(fù)荷紅白血病后的生存時(shí)間的差異，以LSD法行組間比較；以P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

4、　　 1.MHC單倍體相合供者淋巴細(xì)胞輸注誘導(dǎo)的小鼠慢性GVHD動(dòng)物模型的建立。
　　 (1)嵌合體檢測：輸注6×107、9×107個(gè)Balb/c小鼠脾細(xì)胞組在2、5、8、12周均可檢測出亮度較為均一的DNA條帶，即形成了較為穩(wěn)定的供受者混合嵌合體；輸注3×107個(gè)Balb/c小鼠脾細(xì)胞組在2、5周可檢測出亮度較弱的DNA條帶，但8、12周未能檢測出DNA條帶，即未能形成穩(wěn)定的供受者混合嵌合體；輸注6×107個(gè)C57BL/6J

5、J小鼠脾細(xì)胞組移植組2、5、8周可檢測出較亮的DNA條帶，但在第12周檢測出和輸注6×107、9×107個(gè)Balb/c小鼠脾細(xì)胞組亮度相似的條帶，即起初形成高水平的供受者混合嵌合體，嵌合水平隨時(shí)間的推移而降低。
　　 (2)根據(jù)慢性GVHD的病理評分標(biāo)準(zhǔn)確定各組小鼠的患病狀態(tài)，對皮膚改變、體重減輕、腹瀉和弓背體態(tài)四項(xiàng)觀察指標(biāo)進(jìn)行二分類Logistic回歸危險(xiǎn)度分析顯示，模型似然比檢驗(yàn)P=0.041，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；按P≤0

6、.05與發(fā)病關(guān)系密切的變量是皮膚改變和體重減輕，Ps=0.000，Pw=0.037；以預(yù)測概率0.05為判別分界點(diǎn)，總判對率為95.8％。因此，皮膚改變和體重減輕是本模型較為敏感的臨床觀察指標(biāo)。
　　 (3)各組小鼠的臨床表現(xiàn)：輸注不同數(shù)量Balb/c小鼠脾細(xì)胞后，各組受鼠出現(xiàn)不同程度的慢性GVHD的表現(xiàn)，輸注等體積的RPMI1640的受鼠未出現(xiàn)慢性GVHD的表現(xiàn)，輸注C57BL/6JJ小鼠脾細(xì)胞組最初出現(xiàn)急性GVHD的表現(xiàn)，但

7、小鼠并未死亡，后期則出現(xiàn)慢性GVHD的表現(xiàn)；log-rank檢驗(yàn)A、B、C實(shí)驗(yàn)組和對照組發(fā)病率的Kaplan生存曲線差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，按校正后的檢驗(yàn)水準(zhǔn)P≤0.0071，B、C實(shí)驗(yàn)組和對照組之間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，A實(shí)驗(yàn)組和對照組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)，B、C實(shí)驗(yàn)組和A實(shí)驗(yàn)組之間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，B、C實(shí)驗(yàn)組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.302)；以H檢驗(yàn)比較A、B

8、、C組小鼠GVHD的嚴(yán)重程度差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)，按校正后的檢驗(yàn)水準(zhǔn)P≤0.0125，A、B實(shí)驗(yàn)組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，A、B實(shí)驗(yàn)組和C實(shí)驗(yàn)組之間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.015)；A、B、C組小鼠皮膚改變評分和體重減輕評分的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.199)。根據(jù)慢性GVHD的臨床評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，輸注6×107、9×107個(gè)Balb/c小鼠脾細(xì)胞組成功的誘導(dǎo)出了慢性GVHD，輸注6×107組臨床表現(xiàn)最典型

9、。
　　 (4)各組小鼠的病理表現(xiàn)：輸注后100天，斷頸處死所有小鼠，A、B、C組受鼠檢測出不同程度的慢性GVHD的病理損害，各組慢性GVHD的發(fā)生率分別為4/12、11/12、11/12，輸注等體積的RPMI1640的受者未檢測出慢性GVHD的病理損害，輸注C57BL/6JJ小鼠脾細(xì)胞組早期出現(xiàn)急性GVHD的病理損害(行嵌合體分析小鼠的病理標(biāo)本)，輸注后100天則檢測出慢性GVHD的病理損害。根據(jù)慢性GVHD的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對肝臟

10、、皮膚和小腸的病理表現(xiàn)評分，以H檢驗(yàn)比較A、B、C組小鼠GVHD的嚴(yán)重程度差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)，按校正后的檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.0125，A、B實(shí)驗(yàn)組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)，A、B實(shí)驗(yàn)組和C實(shí)驗(yàn)組之間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.032)；A、B、C組小鼠肝臟、皮膚和小腸病理改變的嚴(yán)重程度差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.070)。根據(jù)慢性GVHD的病理評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，輸注6×107、9×107個(gè)Balb/c小鼠脾細(xì)胞組成功的

11、誘導(dǎo)出了慢性GVHD，輸注6×107組病理表現(xiàn)最典型。
　　 2.體內(nèi)觀察阻斷CD4+T細(xì)胞活化的雙信號(hào)系統(tǒng)對小鼠慢性GVHD的影響。
　　 (1)嵌合體檢測：
　　 (2)慢性GVHD動(dòng)物模型的重復(fù)性檢驗(yàn)：
　　 (3)各組小鼠的臨床表現(xiàn)：
　　 (4)各組小鼠的病理表現(xiàn)：
　　 3.體內(nèi)觀察阻斷CD4+T細(xì)胞活化的雙信號(hào)系統(tǒng)對GVL效應(yīng)的影響。
　　 腹腔接種FBL-3細(xì)胞后，

12、觀察各組小鼠的生存期，空白對照組的平均生存時(shí)間為8.00±1.00天，慢性GVHD組的平均生存時(shí)間為6.42±0.55天，TJU103組的平均生存時(shí)間為9.20±1.30天，CTLA4-Ig組的平均生存時(shí)間為11.00±1.26天，TJU103+CTLA4-Ig組的平均生存時(shí)間為15.40±1.52天，單因素方差分析比較各組小鼠的平均生存時(shí)間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.897 P=0.000)，以LSD法進(jìn)行組間比較，TJU103組和對

13、照組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.119)，其余各組組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.042)。取頻死小鼠行病理學(xué)檢查，肝臟表面可見明顯的腫塊結(jié)節(jié)，部分小鼠肺組織塌陷；鏡下HE染色可見肝、脾、肺組織及骨髓白血病細(xì)胞彌漫性浸潤，主要為幼稚細(xì)胞，正常組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。
　　 4.單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)體外監(jiān)測各組小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)、對MHC單倍體相合移植物的殺傷效應(yīng)和對紅白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　 結(jié)論：

14、>　　 1.輸注6×107和9×107個(gè)Balb/c供鼠脾細(xì)胞的受鼠鼠成功建立了MHC單倍體相合供者淋巴細(xì)胞輸注誘導(dǎo)的慢性移植物抗宿主病；毛發(fā)改變和體重減輕是敏感的臨床評價(jià)指標(biāo)，肝臟、皮膚和腸道是敏感的病理評價(jià)指標(biāo)；模型組具有較好的可重復(fù)性。
　　 2.應(yīng)用TJU103阻斷CD4-T細(xì)胞活化的第一信號(hào)可推遲慢性GVHD的發(fā)病時(shí)間，應(yīng)用CTLA4-Ig阻斷CD4-T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)可降低慢性GVHD的發(fā)生率，聯(lián)合應(yīng)用TJU1

15、03和CTLA4-Ig可降低慢性GVHD的發(fā)生率的作用更加明顯。
　　 3.移植后100天腹腔接種小鼠紅白血病細(xì)胞后，慢性GVHD縮短了小鼠的生存時(shí)間；TJU103干預(yù)組和空白對照對照組的生存時(shí)間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTLA4-Ig組和TJU103+CTLA4-Ig組明顯的延長了荷紅白血病小鼠的生存時(shí)間，以后者效應(yīng)最強(qiáng)。
　　 4.TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig均可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和對M

16、HC單倍體相合同種異體移植物的殺傷效應(yīng)，其中TJU103的抑制效應(yīng)經(jīng)歷了從強(qiáng)到弱的轉(zhuǎn)變；TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig對紅白血病細(xì)胞殺傷效應(yīng)無明顯影響。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：建立了MHC單倍體相合供者淋巴細(xì)胞輸注誘導(dǎo)的慢性GVHD動(dòng)物模型；在上述模型的基礎(chǔ)上證實(shí)了TJU103可推遲慢性GVHD的發(fā)病時(shí)間，CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig可減少慢性GVHD的發(fā)生率， CTLA4-I