病毒性腦炎HCV和BDV感染的基礎(chǔ)應(yīng)用研究.pdf

1、目的：建立檢測(cè)外周血液(PB)和腦脊液(CSF)丙型肝炎病毒(HCV)和博爾納病病毒(BDV)的巢式逆轉(zhuǎn)錄酶熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-nRT-PCR)的方法，快速、準(zhǔn)確地定量檢測(cè)外周血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞(PBMCs)和CSFHCVEl和BDVp24基因片段，進(jìn)一步證實(shí)病毒性腦炎(VE)是否存在HCV或BDV感染。探討寧夏及其周邊地區(qū)綿羊是否存在BDV感染。對(duì)BDV陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測(cè)定、同源性和氨基酸順序分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，初探BDV感

2、染的分子流行病學(xué)特征。 方法： 1、根據(jù)HCVEl基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物和熒光標(biāo)記探針。將PCR擴(kuò)增的HCV基因片段克隆入載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定，作為陽(yáng)性模板，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和樣品檢測(cè)，建立檢測(cè)HCV的FQ-nRT-PCR方法。 2、應(yīng)用FQ-nRT-PCR方法檢測(cè)28例丙型病毒性肝炎、46例VE患者及42例對(duì)照者PBMCs和CSFHCVEl基因片段，并應(yīng)用反向點(diǎn)雜交技術(shù)，對(duì)HCV感染的病例進(jìn)行HCV基

3、因型檢測(cè)。 3、應(yīng)用徐平等開發(fā)的BDV重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性模板，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和樣品檢測(cè)，建立FQ-nRT-PCR檢測(cè)CSFBDVp24的方法。 4、應(yīng)用FQ-nRT-PCR方法檢測(cè)52例VE和42例對(duì)照者PBMCs和CSFBDVp24基因片段以及384只綿羊的PBMCsBDVp24基因片段。 5、采用SPSSl3．O統(tǒng)計(jì)軟件包，對(duì)BDV感染陽(yáng)性的VE和綿羊進(jìn)行皮爾遜X2檢驗(yàn)分析，探討其感染季節(jié)和地域分布的特征。

4、應(yīng)用DNAtools6．0、clustalxl．83軟件和BLASTN程序分析，與GenBank提供的不同時(shí)間、地點(diǎn)分離的國(guó)外BDV流行株和標(biāo)準(zhǔn)病毒株進(jìn)行同源性和氨基酸順序分析。 結(jié)果： 1、應(yīng)用HCV和BDV重組質(zhì)粒制作的定量曲線循環(huán)閾值與模板具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0．849和0．860,建立了檢測(cè)PBMCs和CSFHCVEl和BDVp24的FQ-nRT-PCR方法。 2、VE組患者PBMCs和CS

5、FHCVEl基因片段陽(yáng)性率分別為8．69％(4／46)和6．52％(3／46)明顯高于對(duì)照組O％(O／42)(p<0．05)；PBMCs和CSFHCVEl基因片段拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈顯著正相關(guān)(p<0．05)。 3、VE急性期患者PBMCs和CSFBDVp24基因片段的陽(yáng)性率(分別為9．6％和¨．5％)明顯高于恢復(fù)期(均為2．78％)(p<0．05)和對(duì)照組(O)(p<0．01)。VE急性期患者的PBMCs和CSFBDVp24基因片

6、段拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān)(p<0．05)。綿羊PBMCsBDVp24基因片段陽(yáng)性率為7．81％。經(jīng)單因素卡方檢驗(yàn)，發(fā)熱、精神癥狀、意識(shí)障礙和腦電圖的異常等臨床特征在BDVp24陽(yáng)性與陰性的VE患者間存在顯著性差異(p<0．05)。 4、將BDVp24陽(yáng)性的VE和綿羊來(lái)源季節(jié)，按照一年四季順序排列，第四季度BDV感染的總陽(yáng)性率明顯高于第一季度、第二季度和第三季度(p<0．05)。以銀川市和陜西睛邊為界，將標(biāo)本來(lái)源地分為南部地區(qū)和北部地

7、區(qū)，北部地區(qū)BDV感染的總陽(yáng)性率明顯高于南部地區(qū)(p<0．05)。 5、VECSF和綿羊PBMCs擴(kuò)增目的基因片段與GenBank提供的BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株V核苷酸序列比較同源性為96．5l％，在3個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變(ntl649T→C，ntl670C→T，ntl673C→T)，突變率為3．49％，所編碼的氨基酸第549位的I由T代替，第556位的S由F代替，第557位的S由L代替。與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株He／80核苷酸序列比較同源性為96

8、．51％，在3個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變(ntl658A→C,ntl667A→G，ntl670C→T)，突變率為3．49％，所編碼的氨基酸第555位的E由F代替，第556位的S由L代替，第557位的L由S代替。VE患者CSF和綿羊PBMCs的BDVp24基因片段序列相同，考慮可能來(lái)源于同一種病毒株。系統(tǒng)發(fā)生樹表明，該目的基因片段與德國(guó)H1766病毒株核苷酸序列親緣關(guān)系最近，來(lái)源于一個(gè)分支，其變異性較小。 結(jié)論： 1、建立的FQ-nR

9、T-PCR檢測(cè)血液和CSFHCVEl和BDVp24方法，具有特異性和靈敏度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、簡(jiǎn)便和快捷等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果以拷貝數(shù)來(lái)表示，有利于標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，在基礎(chǔ)和臨床研究中具有廣泛的應(yīng)用港力。 2、病毒性腦炎部分存在有HCV感染，HCVlb型可能為導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)HCV感染的主要基因型。 3、病毒性腦炎部分存在有BDV感染，發(fā)熱、精神癥狀、意識(shí)障礙和腦電圖的異?？赡転锽DV性腦炎急性期患者的主要臨床特征。 4、寧