多酚類化合物與血清白蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)-結(jié)合力關(guān)系、理論模型和應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，中藥活性成分與血清蛋白質(zhì)的相互作用已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注。中藥活性小分子在人體血液中與血漿載體蛋白的相互作用直接影響藥物的分布、排泄、代謝、活性和毒副作用。中藥活性成分與血液載體蛋白的相互作用研究可以為營養(yǎng)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)提供重要的信息，對(duì)了解藥物在體內(nèi)的代謝過程，闡明藥物的作用機(jī)制，研究藥代動(dòng)力學(xué)以及藥物的毒性，解釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系和開發(fā)新藥等都有重要的意義。本論文主要研究多酚類化合物和牛血清白蛋白之間的相互作用，選擇常見

2、的有代表性的黃酮類化合物和白藜蘆醇，研究中藥小分子與生物大分子相互作用的結(jié)構(gòu).結(jié)合力關(guān)系、理論模型及其應(yīng)用。 1.多光譜法研究葛根素與牛血清白蛋白的相互作用 采用熒光光譜，紅外光譜，共振散射光譜和同步熒光光譜考察了葛根素與牛血清白蛋白的相互作用。在20℃和30℃時(shí)，葛根素和牛血清白蛋白之間的表觀結(jié)合常數(shù)(Ka)分別是1.13×104 L/mol(20℃)和1.54×104L/mol(30℃)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)是0.95±

3、0.02。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根素可以通過插入到牛血清白蛋白分子內(nèi)部，通過形成葛根素-牛血清白蛋白的配合物來猝滅其內(nèi)源熒光。隨著葛根素濃度的增加，牛血清白蛋白的共振散射強(qiáng)度減弱，在溶液中呈現(xiàn)聚集的形態(tài)。靜態(tài)猝滅和無輻射能量轉(zhuǎn)移都是導(dǎo)致熒光猝滅的主要原因。正的熵變和焓變表明葛根素和牛血清白蛋白之間主要是疏水作用力。吉布斯自由能變是負(fù)值說明這個(gè)過程是自發(fā)的。 2.黃酮醇B環(huán)羥基對(duì)其與血清白蛋白作用的影響 黃酮醇B環(huán)多羥基對(duì)電子共

4、振和轉(zhuǎn)移起重要作用，黃酮醇B環(huán)多羥基也是其清除自由基能力的決定因素。然而黃酮醇B環(huán)羥基對(duì)其與血清蛋白作用的影響還不清楚。高良姜素，山奈酚，槲皮素和楊梅素具有相同的A環(huán)和C環(huán)結(jié)構(gòu)，僅B環(huán)上的羥基數(shù)目不同，通過測定它們與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)具有相同A環(huán)和C環(huán)結(jié)構(gòu)的黃酮醇，其B環(huán)羥基的增加將增強(qiáng)其與血清白蛋白的作用，B環(huán)上每增一個(gè)羥基可以提高結(jié)合常數(shù)1個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)研究了黃酮醇的疏水常數(shù)(lgKow)和在C18柱上的色譜保留指

5、數(shù)(K')與結(jié)合常數(shù)(lgKa)的關(guān)系。親脂性越高的黃酮醇，其與牛血清白蛋白的結(jié)合力越弱；黃酮醇的色譜保留指數(shù)(K')隨B環(huán)羥基的增加而減小。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)黃酮醇的抗氧化性越強(qiáng)則與牛血清白蛋白的結(jié)合力越大。 3.黃酮羥基的糖苷化對(duì)其與血清蛋白作用的影響 天然的生物類黃酮多是以糖苷形式存在于植物中，在人體內(nèi)被酶水解成黃酮苷元才能發(fā)揮其藥效作用。黃酮苷元比黃酮苷更易被人體吸收。然而黃酮羥基的糖苷化對(duì)其與血清蛋白作用的影響還不

6、清楚。論文研究了四種黃酮苷元及其常見的黃酮苷與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果表明黃酮母環(huán)上的羥基被糖苷取代后將削弱其與血清白蛋白的作用，導(dǎo)致其與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)降低1-3個(gè)數(shù)量級(jí)。槲皮素與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)是槲皮苷與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)的5000多倍，而染料木素與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)僅為染料木苷與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)的6倍。 4.應(yīng)用藥物與牛血清白蛋白相互作用研究表沒食子兒茶酚沒食子酸酯(EGCG)增強(qiáng)

7、石杉?jí)A甲對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制效果 課題組研究發(fā)現(xiàn)EGCG可以在體內(nèi)增強(qiáng)石杉?jí)A甲對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制效果，降低石杉?jí)A甲的使用量而具有同樣的效果，然而相關(guān)機(jī)理還不清楚。論文通過研究EGCG和石杉?jí)A甲與牛血清白蛋白的相互作用來解釋增強(qiáng)機(jī)理。熒光光譜顯示EGCG與牛血清白蛋白之間有很強(qiáng)的結(jié)合力，石杉?jí)A甲與牛血清白蛋白之間幾乎沒有作用力，但在EGCG存在下，石杉?jí)A甲可以接近牛血清白蛋白的氨基酸殘基并與牛血清白蛋白發(fā)生作用。同步熒光研究顯示

8、，EGCG與牛血清白蛋白形成配合物后對(duì)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境都有影響；在EGCG存在下，石杉?jí)A甲接近牛血清白蛋白酪氨酸殘基，石杉?jí)A甲的加入增強(qiáng)了EGCG和牛血清白蛋白酪氨酸殘基的結(jié)合力。酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境受到明顯的改變，而石杉?jí)A甲遠(yuǎn)離色氨酸殘基，對(duì)色氨酸殘基沒有影響。紅外光譜顯示EGCG比石杉?jí)A甲更能影響牛血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，可能的機(jī)理是EGCG首先和血清白蛋白的酪氨酸殘基通過氫鍵形成穩(wěn)定的配合物，然后石杉?jí)A

9、甲通過氫鍵與EGCG-血清白蛋白配合物中的EGCG發(fā)生作用，并通過EGCG遠(yuǎn)距離傳遞電子給血清白蛋白酪氨酸殘基，增加了EGCG和血清白蛋白酪氨酸殘基的結(jié)合力。與EGCG相比，GCG與牛血清白蛋白的結(jié)合力降低了100倍。EGCG與GCG具有相似的結(jié)構(gòu)，差異僅在2位上空間結(jié)構(gòu)，說明手性異構(gòu)體影響其與BSA的相互作用。 5.基于生物大分子熒光猝滅的二項(xiàng)式分布模型用于分析藥物小分子與生物大分子的相互作用--以白藜蘆醇和牛血清白蛋白為例

10、 藥物小分子和血清白蛋白存在高結(jié)合力和低結(jié)合力的結(jié)合位點(diǎn)，通常通過Stern-Volmer方程和雙對(duì)數(shù)曲線方程及其修改形式獲得的結(jié)合常數(shù)僅反映具有高結(jié)合力的結(jié)合位點(diǎn)。與具有高結(jié)合力的位點(diǎn)相比，低結(jié)合力的位點(diǎn)實(shí)際上并沒有被藥物分子占據(jù)。因此藥物實(shí)際占據(jù)的位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)是不同的，許多模型沒有考慮到這一點(diǎn)。本文在此基礎(chǔ)上，以白藜蘆醇和牛血清白蛋白為例，建立了一個(gè)基于生物大分子熒光猝滅的二項(xiàng)式分布模型用于研究藥物小分子和生物大分子的相

11、互作用，并用同步熒光和紅外光譜深入了解白藜蘆醇和牛血清白蛋白的相互作用。白藜蘆醇與牛血清白蛋白的主要作用方式是范德華力和氫鍵作用力，△G是負(fù)值說明該過程是自發(fā)的。同步熒光光譜表明白藜蘆醇與牛血清白蛋白色氨酸殘基和酪氨酸殘基很接近，影響了色氨酸殘基和酪氨酸殘基的微環(huán)境。白藜蘆醇更能影響酪氨酸殘基，不僅猝滅酪氨酸殘基的熒光強(qiáng)度而且引起酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長藍(lán)移。在牛血清白蛋白的紅外光譜中表征其二級(jí)結(jié)構(gòu)中酰胺I的特征峰(1620-1700