配伍對白芍中芍藥苷煎出量的影響及對大鼠乳腺增生病作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifora Pall.的干燥根,味辛、酸,微寒,歸肝、脾經(jīng)。白芍具有平肝止痛,養(yǎng)血調(diào)經(jīng),斂陰止汗的功效。臨床用于治療頭痛眩暈,脅痛,腹痛,四肢攣痛,血虛萎黃,月經(jīng)不調(diào),自汗,盜汗等?，F(xiàn)代藥理研究表明,白芍有效成分芍藥苷具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、解痙解熱及免疫調(diào)節(jié)等作用。
　　 中藥配伍應(yīng)用是中醫(yī)治療疾病的主要形式。中藥通過配伍不僅能增強(qiáng)治療效果,擴(kuò)大治療范圍,適應(yīng)復(fù)雜病情,且可減少不良反應(yīng),防止藥

2、物中毒?！秱摗分杏涊d白芍配柴胡,二藥合用,疏肝之中斂肝,升陽之中斂陰,補(bǔ)肝體而和肝用,使肝氣得疏,肝血得補(bǔ),疏柔相濟(jì),動靜結(jié)合,以發(fā)揮肝藏血、主疏泄之功能,可治療情志不遂、肝氣郁結(jié)所致情緒抑郁或急躁易怒、胸脅苦滿、兩脅及乳房脹痛、月經(jīng)不調(diào)等。白芍通過與常用肝經(jīng)藥物柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花等配伍,可廣泛用于多種疾病的治療。據(jù)文獻(xiàn)考證國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),其臨床作用皆與白芍中所含的活性成分——芍藥苷有關(guān)。
　　 乳腺增生病(HMG)是中

3、青年婦女的常見病、多發(fā)病,屬于中醫(yī)“乳癖”范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病根源乃肝氣郁結(jié)所致,其發(fā)生與肝、脾、胃的經(jīng)脈及沖任二脈有密切的關(guān)系,尤其與肝經(jīng)有密切關(guān)系,大多與肝郁有關(guān),多采用“木郁達(dá)之”治法,其療效確切。目前由于生活節(jié)奏的加快,工作壓力加大,因而臨床上肝郁氣滯型乳腺增生病見之最多。
　　 故本實(shí)驗(yàn)以芍藥苷作為研究的重要指標(biāo),主要觀察其與常用肝經(jīng)藥物柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花等配伍后對其主要成分芍藥苷煎出量的影響,以揭示中藥配伍形式的內(nèi)涵,

4、為臨床配伍應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。但芍藥苷的含量與臨床白芍的配伍其柔肝、養(yǎng)血、止痛作用是否存在正相關(guān)性尚未見報(bào)道,故進(jìn)一步做動物實(shí)驗(yàn)研究。
　　 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)合中醫(yī)對乳腺增生病的病因病機(jī)認(rèn)識,采用束縛制動加連續(xù)、不定時(shí)強(qiáng)迫游泳方法復(fù)制肝郁氣滯型乳腺增生病的動物模型,并選用具有養(yǎng)血柔肝止痛作用的白芍作為主藥,通過與柴胡、或當(dāng)歸、或玫瑰花的配伍對大鼠乳腺增生病的治療作用機(jī)制進(jìn)行研究,進(jìn)一步探索芍藥苷與白芍配伍養(yǎng)血、柔肝、止痛作用的相關(guān)性,為

5、今后臨床配伍應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　 第一部分柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花對白芍中芍藥苷煎出量的影響研究
　　 本實(shí)驗(yàn)分別采用薄層色譜法(TLC)定性鑒別和高效液相色譜法(HPLC)定量測定單味白芍及白芍與柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花配伍后,其芍藥苷的含量變化,從而考察傳統(tǒng)配伍的科學(xué)性。
　　 目的:研究配伍柴胡、或當(dāng)歸、或玫瑰花對白芍中芍藥苷煎出量的影響。
　　 方法:(1)鑒別方法的研究:采用薄層色譜法,選用合適的提取溶

6、劑和方法,以氯仿:甲醇(4:1)為展開劑,5％香草醛硫酸溶液為顯色劑,芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品作為對照品,對白芍水煎液及白芍配柴胡、白芍配當(dāng)歸、白芍配玫瑰花水煎液中的芍藥苷進(jìn)行定性鑒別分析。(2)芍藥苷的含量測定:①色譜條件:選擇合適的固定相,調(diào)整流動相的組成、配比、流速以使芍藥苷色譜峰與其它峰完全分離。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制系列濃度的芍藥苷對照品溶液,分別進(jìn)樣,按含量測定方法測定峰面積,以芍藥苷對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲

7、線。③精密度試驗(yàn):精密量取芍藥苷對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,在色譜條件下測定峰面積。④穩(wěn)定性試驗(yàn):精密量取同一份供試品溶液,在48小時(shí)內(nèi)于不同時(shí)間注入高效液相色譜儀,分別測定峰面積。⑤重復(fù)性試驗(yàn):精密量取同一份供試品溶液,平行進(jìn)樣5次,分別測定峰面積。⑥回收率試驗(yàn):采用加樣回收率測定法,取已知含量的樣品溶液適量,每組分別加入適量的芍藥苷對照品,對所得樣品分別進(jìn)樣,在上述色譜條件下測定峰面積,計(jì)算回收率。⑦樣品含量測定:分別精密量取供試品溶

8、液,在上述色譜條件下測定峰面積,計(jì)算其中的芍藥苷含量。
　　 結(jié)果:(1)鑒別方法的研究:采用相應(yīng)的薄層鑒別方法,供試品溶液與對照品溶液在相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn),斑點(diǎn)清晰,陰性對照無干擾。(2)芍藥苷的含量測定:①色譜條件:色譜柱為Diamonsic C18柱(200×4.6 mm,5μm);流動相:甲醇—水(40:60);檢測波長:230nm;流速:1.0ml/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μl;在此色譜條件下,芍藥苷保

9、留時(shí)間約為8min,分離度大于1.5,理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算,應(yīng)不低于2000。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:芍藥苷在0.0974～0.5846μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為y=1452.3x+12.614(R2=0.9998,n=5)。③精密度試驗(yàn):儀器的精密度良好,RSD值為0.24％(n=5)。④穩(wěn)定性試驗(yàn):樣品在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定,RSD值為0.43％(n=6)。⑤重復(fù)性試驗(yàn):本方法重現(xiàn)性良好,RSD值為0.15％(n=5)。⑥回收率試驗(yàn)

10、:芍藥苷的平均回收率為99.55％,RSD值為0.56％(n=9),表明回收率較高,方法準(zhǔn)確可靠。⑦樣品含量測定:白芍與柴胡等份煎煮液中芍藥苷煎出量為29mg/g,與單味藥白芍(19.8mg/g)相比明顯提高46％以上;白芍與當(dāng)歸等份煎煮液中芍藥苷煎出量為24.6mg/g,較單味藥白芍明顯提高21％;白芍與玫瑰花等份煎煮液中芍藥苷煎出量為33.4mg/g,與單味藥白芍比較明顯提高69％;白芍與柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花等份煎煮液中芍藥苷煎出量為

11、32.0mg/g,與單味藥白芍相比明顯提高62％;表明白芍配伍柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花后芍藥苷煎出量較單味白芍顯著提高。
　　 結(jié)論:薄層色譜法操作簡便、快速、準(zhǔn)確,適用于芍藥苷的定性鑒別;高效液相色譜(HPLC)法所建立的方法準(zhǔn)確度和精密度良好,芍藥苷含量測定結(jié)果表明常用藥物柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花與白芍配伍后均能明顯提高其芍藥苷的煎出量。
　　 第二部分不同藥物配伍白芍對大鼠乳腺增生病作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　 本實(shí)驗(yàn)采用

12、束縛制動加連續(xù)、不定時(shí)強(qiáng)迫游泳方法復(fù)制肝郁氣滯型乳腺增生病的動物模型,并結(jié)合中醫(yī)對本病的病因病機(jī)、常用藥物特點(diǎn)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的生理病理變化認(rèn)識等,選用具有養(yǎng)血柔肝止痛作用的白芍作為主藥,通過與柴胡、或當(dāng)歸、或玫瑰花的配伍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察,來進(jìn)一步探討配伍對白芍養(yǎng)血柔肝止痛作用的影響,以便更好的揭示配伍對中藥原有作用與其有效成分的相關(guān)性。
　　 目的:探討白芍與常用藥物(柴胡、當(dāng)歸、玫瑰花)配伍對大鼠乳腺增生病的治療作用機(jī)制。
　　

13、 方法:本實(shí)驗(yàn)采用束縛制動加連續(xù)、不定時(shí)強(qiáng)迫游泳方法復(fù)制肝郁氣滯型乳腺增生病的動物模型。將大鼠放入自制網(wǎng)狀紗袋中后,置于25℃水中強(qiáng)迫游泳5～10min,1次/d,不定時(shí)、間斷進(jìn)行30d,共計(jì)25次,復(fù)制肝郁氣滯型乳腺增生大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠第2、3對乳頭直徑與正常對照組相比明顯增大(P＜0.05或P＜0.01),模型制作成功。造模成功后將大鼠隨機(jī)分為A(空白)組、B(模型)組、C(治療)組,包括C1(白芍)組、C2(白芍+柴胡)組、C

14、3(白芍+當(dāng)歸)組、C4(白芍+玫瑰花)組和C5(白芍+柴胡+當(dāng)歸+玫瑰花)組。除空白組、模型組灌胃給予相應(yīng)量生理鹽水外,其治療各組大鼠均灌胃給相應(yīng)藥物,每日用藥劑量為16g/kg(相當(dāng)于成人劑量的10倍),各組1次/d,連續(xù)30d。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均自由飲水和給予普通飼料飼養(yǎng)。30d后將大鼠斷頭取血,測定血清中生殖激素六項(xiàng)水平,用游標(biāo)卡尺測量大鼠第2、3對乳頭根部直徑,再取下第3對完整的乳房組織,用4％的多聚甲醛固定,石蠟包埋,HE染色,