針刺調節(jié)Notch信號介導氣道高反應Foxp3-RoRγt失衡的機制研究.pdf

1、氣道高反應性(Bronchial Hyperresponsiveness，BHR)是指氣道對正常不引起或僅引起輕度應答反應的特異性抗原刺激和非特異性刺激，出現(xiàn)過度反應，發(fā)生氣道過度狹窄或支氣管收縮。以氣道高反應為主要特征的支氣管哮喘是當前全球范圍內危害人類健康的常見慢性病，發(fā)病率占普通人群的1％-18％（哮喘國際指南GINA2014）[1]，據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內有超過三億的哮喘患者，雖然近年來防治哮喘的工作不斷深入，但是其發(fā)病率及死亡率仍

2、呈上升趨勢[2]。且BHR不僅僅發(fā)生于哮喘患者，而且常常發(fā)生在一些呼吸系統(tǒng)疾患的患者，諸如伴隨肺氣腫、過敏性鼻炎、慢性支氣管炎以及上、下呼吸道感染等疾患的患者[3，4]。此類患者在圍術期極易發(fā)生支氣管痙攣、肺水腫等危急情況，已成為嚴重影響人們身心健康的公共衛(wèi)生問題。有研究發(fā)現(xiàn)氣道反應性疾病患者術中和術后支氣管痙攣的發(fā)生與氣管插管相關，術中支氣管痙攣的發(fā)生率插管全麻(8.9％)要遠高于不插管全麻(0％)[5,6]。而隨著社會的發(fā)展，全麻患

3、者的比例越來越高，因此預防圍術期氣道高反應的的發(fā)生尤為重要，但目前對氣道高反應的發(fā)生機制尚不十分清楚。
　　中醫(yī)藥作為治療氣道高反應的常用措施，其療效已獲得中西醫(yī)呼吸學專家的認可（2013版中國支氣管哮喘防治指南將中醫(yī)藥列入支氣管哮喘的臨床治療中）[7]。針刺作為中醫(yī)藥治療氣道高反應的重要手段，歷代醫(yī)家及近現(xiàn)代臨床研究已證實其可以調節(jié)免疫功能[8,9]，對氣道高反應有良好的治療作用，但是針刺治療氣道高反應的具體作用機制及作用靶點是

4、什么？這仍然是制約傳統(tǒng)針刺療法發(fā)展的“瓶頸”之一。因此，本課題擬建立卵清蛋白(OV-albumin，OVA)致敏氣道高反應BALB/c(BALB/cAnNCrl)小鼠模型，觀察傳統(tǒng)針刺療法對OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠的作用，并以此為基礎探討針刺通過Notch信號介導調節(jié)氣道高反應小鼠Foxp3/RoR失衡的機制，以期為針刺在圍術期氣道高反應中的應用提供理論和實驗依據(jù)。
　　第一節(jié)針刺對OVA致敏BALB/c小鼠氣道高反應

5、的影響
　　目的:
　　觀察傳統(tǒng)針刺療法對OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠的作用。
　　方法:
　　一、氣道高反應模型的建立及分組:
　　SPF級BALB/c小鼠30只，6～8周，體重18～20g，隨機分為正常對照組(NC組)10只，氣道高反應模型組（BHR組）10只，針刺模型組(ACA組)10只。
　　（一）、氣道高反應模型組（BHR組）:參照文獻的方法BALB/c小鼠在實驗室適應三天，分別于第

6、4、11、18天腹腔注射以無菌生理鹽水溶解的卵蛋白(50μg)和氫氧化鋁(2mg)混懸液0.2ml致敏，第25天予以1％卵蛋白滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;
　　（二）、正常對照組(NC組):正常對照組(NC組):BALB/c小鼠分別于第4、11、18天腹腔注射以生理鹽水0.2ml致敏，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;第25天予以1％卵蛋白

7、麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天;
　　（三）、針刺模型組（ACA組）:氣道高反應模型制作同氣道BHR組，且于第13天開始捆綁固定小鼠，針刺足三里(3mm)、大椎(3mm)，（參照針刺治療哮喘臨床選穴規(guī)律），平補平泄，隔天一次，每次20分鐘，（參照小鼠常用針灸穴位），共7次。于第4、11、18天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50μg和氫氧化鋁2mg混懸液0.2ml致敏，第25天以1％卵蛋白在小鼠麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連

8、續(xù)3天;
　　三組均于第28天行全身體積描記儀檢測Baseline Perth值，第29天取肺泡灌洗液及肺組織。
　　二、觀察指標
　?。ㄒ唬⒏鹘M小鼠一般情況;
　?。ǘ?、全身體積描記儀記錄乙酰甲膽堿(Methacholine，Mch)激發(fā)后BaselinePerth值;
　?。ㄈ⒂蔑@微鏡觀察肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中白細胞的分類和計數(shù);

9、>　?。ㄋ模?、用光學顯微鏡觀察肺組織病理切片中氣道與肺組織的形態(tài)結構。
　　結果:
　　一、正常對照組（NC組）BALB/c小鼠毛色光澤、體重增加、呼吸頻率及幅度正常;氣道高反應模型組（BHR組）毛色失去光澤、體重減輕、精神較差、呼吸頻率增加、時伴有不同程度的呼吸困難;針刺模型組(ACA組)較BHR組癥狀減輕;
　　二、與NC組比較，BHR組氣道高反應性在不同濃度Mch激發(fā)下明顯升高，當Mch濃度大于3.12 mg/m

10、l后，氣道高反應性明顯升高，且差異有顯著性(P＜0.01);ACA組與BHR組比較，氣道高反應性降低，且乙酰甲膽堿濃度為6.25mg/ml、25mg/ml、50 mg/ml時，差異有顯著性P＜0.01）;
　　三、BHR組BALB/c小鼠的BALF中嗜酸性粒細胞（Eosnophils，EOS）計數(shù)大于NC組，ACA組小于BHR組(P＜0.01);與NC組比較，BHR組、ACA組中性粒細胞(Neutrophil，NEU)較正常組明顯

11、升高，且差異有顯著性(P＜0.01);與NC組比較BHR組、ACA組巨噬細胞(Macrophage，MOP)百分比降低，ACA組較BHR組降低幅度小，差異有顯著性（P＜0.05）;
　　四、BALB/c小鼠肺組織病理HE染色結果顯示NC組肺組織支氣管粘膜上皮細胞排列整齊，無明顯炎癥，支氣管內清潔無明顯分泌物;BHR組支氣管上皮細胞可見局灶性脫落，皺折增多，粘膜充血水腫，支氣管管腔內及肺間質可見分泌物，EOS局灶性浸潤;ACA組支氣

12、管粘膜上皮細胞排列整齊，粘膜輕度充血，管腔內見少許脫落上皮細胞。
　　結論:
　　祖國醫(yī)學傳統(tǒng)針刺療法對OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠的臨床癥狀、氣道高反應性、肺組織病理性形態(tài)學有改善作用。
　　第二節(jié)針刺對氣道高反應小鼠T淋巴細胞分化、Foxp3/RORγ t平衡的影響
　　目的:
　　一、觀察針刺對氣道高反應BALB/c小鼠T淋巴細胞分化的作用;
　　二、觀察針刺對氣道高反應BALB/c小鼠

13、Foxp3/RoRγt平衡的影響。
　　方法:
　　一、氣道高反應模型的建立及分組:
　　SPF級BALB/c小鼠30只，6～8周，體重18～20g，隨機分為正常對照組(NC組)10只，氣道高反應模型組（BHR組）10只，針刺模型組（ACA組）10只。
　?。ㄒ唬獾栏叻磻Ｐ徒M（BHR組）:參照文獻的方法BALB/c小鼠在實驗室適應三天，分別于第4、11、18天腹腔注射以無菌生理鹽水溶解的卵蛋白(50μg)和

14、氫氧化鋁(2mg)混懸液0.2ml致敏，第25天予以1％卵蛋白滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;
　　（二）、正常對照組（NC組）:正常對照組（NC組）: BALB/c小鼠分別于第4、11、18天腹腔注射以生理鹽水0.2ml致敏，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;第25天予以1％卵蛋白麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天;
　?。ㄈ?、針

15、刺模型組（ACA組）:氣道高反應模型制作同氣道BHR組，且于第13天開始捆綁固定小鼠，針刺足三里(3mm)、大椎(3mm)，（參照針刺治療哮喘臨床選穴規(guī)律），平補平泄，隔天一次，每次20分鐘，（參照小鼠常用針灸穴位），共7次。于第4、11、18天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50μg和氫氧化鋁2mg混懸液0.2ml致敏，第25天以1％卵蛋白在小鼠麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天;三組均于第28天取材檢測。
　　二、觀察指標

16、r>　　（一）、通過流式細胞技術檢測針刺介導OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠脾內CD4+ CD25+調節(jié)性T細胞和Th17細胞百分比;
　?。ǘ?、免疫組化檢測針刺對氣道高反應CD4+CD25+調節(jié)性T細胞和Th17細胞特異性轉錄因子Foxp3、RORγt蛋白表達;
　?。ㄈT-PCR檢測肺組織中CD4+ CD25+調節(jié)性T細胞和Th17細胞特異性轉錄因子Foxp3mRNA、RORγt mRNA表達。
　　結

17、果:
　　一、NC組相比，BHR組及ACA組BALB/c小鼠脾臟中CD4+ CD25+調節(jié)性T細胞的百分比明顯下降(P＜0.01)，BHR組CD4+ CD25+調節(jié)性T細胞的百分比ACA組下降更為明顯，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與NC組比較，BHR組及ACA組Th17細胞占CD4+T細胞的百分比較正常對照組顯著升高(P＜0.01），ACA組CD4+T細胞的百分比較BHR組下降，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　二、

18、免疫組化檢測肺組織中RORγt、Foxp3蛋白表達結果:BHR組及ACA組BALB/c小鼠肺組織RORγt蛋白表達明顯高于NC組(P＜0.01)，ACA組蛋白表達水平降低，但仍高于正常對照組(P＜0.01); BHR組及ACA組BALB/c小鼠肺組織Foxp3蛋白表達明顯低于NC組(P＜0.01)，ACA組蛋白表達水平降低，且與BHR組比較差異有顯著性(P＜0.01)。
　　三、RT-PCR檢測肺組織中RORγt、Foxp3mRN

19、A表達結果:BHR組及ACA組BALB/c小鼠肺組織RORγtmRNA含量明顯高于NC組(P＜0.01)，ACA組RORγtmRNA含量較BHR組水平降低，但仍高于NC組(P＜0.01); BHR組及ACA組BALB/c小鼠肺組織Foxp3mRNAmRNA含量明顯低于NC組(P＜0.01)，ACA組Foxp3mmRNA含量與BHR組比較降低，但無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　一、OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠Treg/

20、Th17、Foxp3/RoRγt失衡，Treg/Th17、Foxp3/RoRγt失衡變化一致，且都與氣道高反應呈負相關;
　　二、傳統(tǒng)針刺療法可影響OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠T淋巴細胞分化，調節(jié)Treg/Th17失衡;
　　三、傳統(tǒng)針刺療法可調節(jié)OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠Foxp3/RoRγt失衡。
　　第三節(jié)針刺介導Notch對氣道高反應BALB/c小鼠FOXP3/RORγ t的作用
　　目

21、的:
　　一、探討Notch信號對氣道高反應BALB/c小鼠Foxp3/RoRγt失衡中的影響;
　　二、觀察針刺介導Notch信號在氣道高反應BALB/c小鼠Foxp3/RoRγt失衡中的作用。
　　方法:
　　一、氣道高反應模型的建立及分組:
　　SPF級BALB/c小鼠30只，6～8周，體重18～20g，隨機分為正常對照組(NC組)10只，氣道高反應模型組（BHR組）10只，針刺模型組（ACA組）10

22、只。
　?。ㄒ唬?、氣道高反應模型組（BHR組）:參照文獻的方法BALB/c小鼠在實驗室適應三天，分別于第4、11、18天腹腔注射以無菌生理鹽水溶解的卵蛋白(50μg)和氫氧化鋁(2mg)混懸液0.2ml致敏，第25天予以1％卵蛋白滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;
　?。ǘ⒄φ战M（NC組）:正常對照組(NC組):BALB/c小鼠分別于第4、11、18天腹腔注

23、射以生理鹽水0.2ml致敏，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;第25天予以1％卵蛋白麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天;
　?。ㄈ?、針刺模型組（ACA組）:氣道高反應模型制作同氣道BHR組，且于第13天開始捆綁固定小鼠，針刺足三里(3mm)、大椎(3mm)，（參照針刺治療哮喘臨床選穴規(guī)律），平補平泄，隔天一次，每次20分鐘，（參照小鼠常用針灸穴位），共7次。于第4、11、18天腹腔注射以PBS溶解的

24、卵蛋白50μg和氫氧化鋁2mg混懸液0.2ml致敏，第25天以1％卵蛋白在小鼠麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天;
　　三組均于第28天取小鼠肺組織檢測。
　　二、觀察指標
　?。ㄒ唬⑼ㄟ^RT-PCR檢測肺組織中Notch1mRNA、Notch3mRNA、CSLmRNA的含量;
　?。ǘ?、Western blot檢測肺組織中Notch1、Notch3、CSL蛋白表達的變化，探討針刺對氣道高反應小鼠Notc

25、h信號的影響。
　　結果:
　　一、RT-PCR檢測肺組織中Notch1 mRNA、Notch3mRNA、CSLmRNA的含量結果:BHR組Notch1mRNA的表達較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，ACA組Notch1mRNA的表達較正常對照組升高(P＜0.05); BHR組、ACANotch3 mRNA的表達較NC組明顯降低(P＜0.01); CSLmRNA的表達三組差異無統(tǒng)計學意義。
　　二、Western

26、blot檢測肺組織中Notch1、Notch3、CSL蛋白表達結果:BHR組、ACA組Notch1蛋白的表達較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，ACA組Notch1蛋白的表達較BHR組降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); BHR組、ACA組Notch3蛋白的表達較NC組明顯降低(P＜0.01)，ACA組組Notch3蛋白的表達較BHR組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);CSL蛋白的表達三組差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論

27、:
　　一、Notch信號介導了BALB/c小鼠氣道高反應的發(fā)生;
　　二、Notch1與BALB/c小鼠氣道高反應呈正相關，與Foxp3/RoRγt比值呈負相關;Notch3與BALB/c小鼠氣道高反應呈負相關，與Foxp3/RoRγt比值呈正相關。
　　三、傳統(tǒng)針刺療法可影響OVA致敏氣道高反應BALB/c小鼠Notch1、Notch3的表達。
　　第四節(jié)針刺通過Notch信號介導調節(jié)Foxp3/RoRγ t

28、平衡的機制
　　目的:
　　探討針刺通過Notch信號介導調節(jié)Foxp3/RoRγt平衡的機制。
　　方法:
　　一、氣道高反應模型的建立及分組:
　　SPF級BALB/c小鼠18只，6～8周，體重18～20g，隨機分為正常對照組(NC組)6只，氣道高反應模型組（BHR組）6只，針刺模型組（ACA組）6只。
　?。ㄒ唬獾栏叻磻Ｐ徒M（BHR組）:參照文獻的方法BALB/c小鼠在實驗室適應三天，分別

29、于第4、11、18天腹腔注射以無菌生理鹽水溶解的卵蛋白(50μg)和氫氧化鋁(2mg)混懸液0.2ml致敏，第25天予以1％卵蛋白滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;
　?。ǘ?、正常對照組(NC組):正常對照組(NC組):BALB/c小鼠分別于第4、11、18天腹腔注射以生理鹽水0.2ml致敏，且于第13～25天開始捆綁固定小鼠，隔天一次，每次20分鐘;第25天予以1％卵

30、蛋白麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次，連續(xù)3天;
　?。ㄈ?、針刺模型組（ACA組）:氣道高反應模型制作同氣道BHR組，且于第13天開始捆綁固定小鼠，針刺足三里(3mm)、大椎(3mm)，（參照針刺治療哮喘臨床選穴規(guī)律），平補平泄，隔天一次，每次20分鐘，（參照小鼠常用針灸穴位），共7次。于第4、11、18天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50μg和氫氧化鋁2mg混懸液0.2ml致敏，第25天以1％卵蛋白在小鼠麻醉后滴鼻吸入激發(fā)，每日一次

31、，連續(xù)3天;三組均于第28天取小鼠肺組織檢測。
　　二、觀察指標
　　染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)實驗確定RORγt、Foxp3與Notch的結合量。
　　結果:
　　一、BHR組BALB/c小鼠肺組織RORγtmRNA與Notch結合量明顯高于NC組，ACA組肺組織RORγtmRNA與Notch結合量水平降低，但仍高于NC組(P＜0.01); BHR組

32、BALB/c小鼠肺組織Foxp3mRNA與Notch結合量明顯低于NC組(P＜0.01），ACA組Foxp3mRNA與Notch結合量水平降低，且與高于BHR組有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　二、Foxp3、RORγt與Notch的結合量的比值與肺組織中Foxp3/RORγt蛋白及基因的表達量的比值呈正相關。
　　結論:
　　針刺通過Notch信號調節(jié)氣道高反應小鼠Foxp3/RoR平衡的作用可能是通過Notch信

33、號與CD4+ CD25+調節(jié)性T細胞和Th17細胞特異性轉錄因子Foxp3、RORγt蛋白直接結合實現(xiàn)的。
　　第五節(jié)針刺對全麻誘導期患者血液動力學及肺順應性的影響
　　目的:
　　觀察針刺對全麻誘導期患者血液動力學及肺順應性的影響。
　　方法:
　　選取40例ASA分級為Ⅰ-Ⅱ級、年齡18-65歲、擬在氣管插管全身麻醉下實施擇期脊柱外科手術的患者。隨機分為兩組，每組20例。分別為針刺組（A組）在術前30m

34、in予2/15Hz疏密波電針刺激病人雙側內關、曲池穴，刺激強度為電流0.5-1mA，時間為30分鐘;對照組（C組）未予電針刺激單純經靜脈全麻誘導。觀察患者一般情況，血液動力學指標及肺通氣相關指標。
　　結果:
　?。ㄒ唬┮话阗Y料比較兩組患者的性別構成比、年齡、體重、身高差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　?。ǘ?、血流動力學指標兩組誘導后的心率、血壓和RPP值都較入室后基礎值及誘導前明顯下降(P＜0.05)，插管即

35、刻、插管后1 min的心血管指標較誘導后明顯增高(P＜0.05)。兩組插管后RPP的值均較誘導后值顯著升高，但A組RPP增高持續(xù)的時間較C組短。且A組插管后10minRPP值較C組低(P＜0.05)。
　?。ㄈ┓瓮庀嚓P指標兩組患者插管后插管即刻(T4)、氣管插管后2min(T5)、10 min(T6)、20 min(T7)Pplat沒有明顯變化;T4、T5、T6 Ppeak沒有明顯變化，T7時間點A組Ppeak較C組及T4時間