海洋異吲哚酮纖溶化合物藥代動力學特性研究.pdf

1、海洋微生物因其擁有極其豐富多樣的種類，并且生存于高壓、低溫、缺氧等獨特的海洋生態(tài)生態(tài)環(huán)境下，往往能夠產(chǎn)生具有優(yōu)良生物活性，并且結(jié)構(gòu)新穎的天然化合物，海洋微生物代謝產(chǎn)物，已成為藥物創(chuàng)新與新藥開發(fā)的重要來源。從海洋生物資源中獲取的小分子纖溶活性化合物與一些傳統(tǒng)的臨床溶栓藥物相比，具有較高的安全性及成本低的優(yōu)勢，而且其來源也更豐富。
　　藥物治療是一個受很多因素影響復雜的過程，藥物代謝動力學特性是最重要的影響因素之一。藥代動力學可以明確

2、藥物的體內(nèi)吸收、器官分布、組織代謝和排泄消除等規(guī)律并為藥效學及毒理學等藥物臨床前研究直接提供研究基礎(chǔ)。因此，藥代動力學在新藥開發(fā)、臨床用藥指導以及藥品質(zhì)量控制方面具有重要的理論與實際意義。
　　本文的研究對象是一種結(jié)構(gòu)新穎并且具有纖溶活性的吡喃并異吲哚酮類化合物，是從長孢葡萄穗霉菌FG216（Stachybotrys longispora FG216）的次級代謝產(chǎn)物中分離純化鑒定得到。FG216是一種珍稀的海洋真菌，為本實驗室于東

3、海海域中分離鑒定所得（保藏號：CCTCC M2012272），其代謝產(chǎn)物被命名為FGFC1（fungi fibrinolytic compound1），F(xiàn)GFC1的化學式 R/S系統(tǒng)命名法的中文名稱為2,5-二((2-(2,4,-二甲基-2,4-二烯)壬基)-(2-甲基-3-羥基)-吡喃并(5-羥基)-異吲哚酮基)-戊酸（2,5-Bis-[8-(4,8-dimethyl-nona-3,7-dienyl)-5,7-dihydroxy-8-

4、methyl-3-keto-1,2,7,8-ter tahydro-6H-pyran[a]isoindol-2-yl]-pentanoic acid），F(xiàn)GFC1通過激活纖溶酶原活性發(fā)揮溶血栓作用的獨特機制，將有可能成為安全而高效的溶血栓新藥。
　　本文對長孢葡萄穗霉菌FG216產(chǎn)異吲哚酮纖溶化合物FGFC1的發(fā)酵條件進行了響應面優(yōu)化，研究了FGFC1的肝微粒體代謝特征和嚙齒動物藥代動力學特性與組織分布規(guī)律。
　　第一章綜述

5、了單因素試驗設(shè)計、均勻試驗設(shè)計、正交試驗設(shè)計、響應面試驗設(shè)計等微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化的方法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）、飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（TOF-MS）、微透析技術(shù)（MD）、核磁共振技術(shù)（NMR）等現(xiàn)代分析技術(shù)在藥代動力學研究中的應用。通過選取合適的優(yōu)化方法及檢測技術(shù)，為后續(xù)的研究提供保障。
　　第二章對長孢葡萄穗霉菌FG216發(fā)酵生產(chǎn)FGFC1的方法進行優(yōu)化研究。通過響應

6、面法優(yōu)化長孢葡萄穗霉菌 FG216發(fā)酵產(chǎn)生纖溶活性化合物 FGFC1的培養(yǎng)條件。以單因素試驗結(jié)果為參考依據(jù)，利用Design-Expert V8.0.6設(shè)計軟件對FG216的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中誘導物鳥氨酸鹽酸鹽添加量以及培養(yǎng)溫度進行 Box-behnken模型的響應面試驗設(shè)計，以每升發(fā)酵液中 FGFC1的產(chǎn)出量為響應值進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，并驗證響應面預測值與FG216培養(yǎng)產(chǎn)生FGFC1實測值的一致性。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)時間為9天，最優(yōu)誘導

7、物添加量為0.5％，最優(yōu)培養(yǎng)溫度為28℃，在此培養(yǎng)條件下，F(xiàn)GFC1的產(chǎn)量可達1978.33mg/L，實測值與響應面預測值接近，說明通過響應面試驗設(shè)計對FG216培養(yǎng)條件的優(yōu)化是有效的。
　　第三章研究了海洋異吲哚酮纖溶化合物 FGFC1在大鼠肝微粒體中的代謝規(guī)律。本章研究建立了FGFC1在生物基質(zhì)中（大鼠肝微粒體）的高效液相色譜檢測方法，并對 FGFC1在大鼠肝微粒體中的降解規(guī)律進行研究，奠定 FGFC1在動物體內(nèi)藥物代謝動力學

8、研究的基礎(chǔ)。FGFC1與大鼠肝微粒體混合孵育后,用甲醇中止反應并沉淀蛋白。離心后取上清液，用0.22μm的針頭過濾器過濾，將濾液進行高效液相色譜檢測。高效液相色譜使用C18反相柱，以乙腈和0.1%三氟乙酸溶液為流動相，梯度洗脫，乙腈和0.1%TFA溶液由45：55（v/v）改變?yōu)?5：15（v/v）歷時30 min并保持30 min不變，流動相流速1mL/min，檢測波長265nm，柱溫40℃。FGFC1在肝微粒體基質(zhì)中線性關(guān)系良好，Y

9、=9497.6 C(μg/mL), R2=0.9991（0.5μg/mL-500μg/mL）。方法的準確度與精密度以及 FGFC1樣品在肝微粒體中的穩(wěn)定性、回收率等都滿足試驗要求。該試驗驗證了肝臟代謝降解FGFC1。
　　第四章研究了海洋異吲哚酮纖溶化合物FGFC1在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特性及組織分布特征。基于建立的FGFC1高效液相色譜檢測方法，研究大鼠體內(nèi)FGFC1量變規(guī)律，分析海洋異吲哚酮纖溶化合物FGFC1的藥代動力學特征

10、，為藥物的臨床研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。高效液相色譜使用C18層析柱，以乙腈和0.1%三氟乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫，乙腈和0.1%TFA溶液由45：55（v/v）改變?yōu)?5：15（v/v）歷時30 min并保持30 min不變，流動相流速1mL/min，檢測波長265nm，柱溫40℃。從大鼠尾靜脈分別注射10mg/kg、20mg/kg劑量的FGFC1注射液，研究大鼠血漿中FGFC1隨時間的變化規(guī)律。從尾靜脈注射20mg/kg劑量的FGFC1

11、分析大鼠組織器官中的FGFC1分布規(guī)律。試驗結(jié)果表明，F(xiàn)GFC1的代謝降解規(guī)律符合二房室代謝模型，給藥量10mg/kg、20mg/kg的赤池值（AIC）分別為-13.102、-20.048，擬合系數(shù)（R2）分別為0.993、0.998，試驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好。FGFC1在10mg/kg、20mg/kg的給藥劑量下，其消除半衰期（t1/2）分別為21.51±2.17及23.22±2.11 min；藥時曲線下面積（AUC0-t）分別為412

12、.19±19.09及899.09±35.86μg/ml*min；機體總消除率（CL）分別為0.023±0.002、0.022±0.002((mg/kg)/(μg/ml)/min)；平均保留時間（MRT）分別為10.15±0.97、9.65±1.40 min。兩個給藥劑量下機體總消除率（CL）及平均保留時間（MRT）沒有顯著差異，這表明 FGFC1在大鼠體內(nèi)為線性消除。組織分布研究結(jié)果表明 FGFC1在靜脈給藥后迅速分布到心、肝、脾、肺、

13、腎、小腸、胃等器官，最高藥物濃度水平在肝臟中檢出。腦組織中未檢測到 FGFC1的存在，這可能是由于 FGFC1不能通過血腦屏障。FGFC1在除小腸外的大部分器官中的變化為從高到低的單調(diào)減少，而在小腸中的變化為先增加后減少，在給藥60 min后仍然保持相對高的濃度水平，這表明肝腸循環(huán)可能存在。
　　本文通過優(yōu)化長孢葡萄穗霉菌FG216發(fā)酵生產(chǎn)纖溶活性化合物FGFC1的培養(yǎng)條件，提高FGFC1的單位產(chǎn)量到1 g/L，為后續(xù)的相關(guān)實驗提