甘草協(xié)同祖師麻治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的配伍機(jī)制研究.pdf

1、祖師麻為瑞香科植物黃瑞香Daphne giraldii Nitsche.、陜甘瑞香D.tanguticaMaxim.或凹葉瑞香D.retusa Hemsl.的干燥莖皮和根皮，能夠祛風(fēng)濕、活血止痛，有小毒，用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛，為西部地區(qū)民間用藥。甘草具有緩急止痛、調(diào)和諸藥及解毒的功效，中醫(yī)有“十方九草”之說(shuō)?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，甘草可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，甘草皂苷類成分甘草酸具有類糖皮質(zhì)激素樣作用，甘草黃酮也具有較強(qiáng)的抗

2、炎作用。民間用藥經(jīng)驗(yàn)表明，甘草配伍祖師麻具有良好的增效減毒作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草提取物能夠顯著提高瑞香素的生物利用度，但其具體機(jī)制尚不清楚。
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Athritis, RA)是一種病因不明的慢性炎性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為釋放自身抗體，產(chǎn)生滑膜炎癥，形成血管翳并破壞軟骨使得周圍關(guān)節(jié)呈非特異性的對(duì)稱性炎癥，發(fā)病機(jī)理目前不甚清楚。采用大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced art

3、hritis，AA)模型，以RA發(fā)病機(jī)制中重要炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以及巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)為指標(biāo)，結(jié)合足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)和膝關(guān)節(jié)組織病理變化的檢查，對(duì)祖師麻-甘草配伍比例進(jìn)行篩選，并初步探討其可能的作用機(jī)制，以期開發(fā)成抗RA新藥。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，祖師麻組、甘草組及祖師麻-甘草配伍組可明顯抑制AA大鼠血清中TNF-α、IL-

4、1β水平異常升高，并且降低滑膜組織中VEGF、MIF的表達(dá)，祖師麻-甘草配伍組藥效優(yōu)于祖師麻組和甘草組。由此推測(cè)祖師麻與甘草，在治療RA時(shí)所表現(xiàn)的抗炎作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、VEGF及MIF等細(xì)胞因子的產(chǎn)生而抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生和血管翳的形成，減輕軟骨和骨破壞，從而發(fā)揮療效。因此，將祖師麻與甘草配伍使用治療RA，可以發(fā)揮協(xié)同增效作用，且祖師麻-甘草(3∶2)是其最佳配伍比例，調(diào)節(jié)血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α、

5、IL-1β及滑膜組織VEGF、MIF的表達(dá)可能是祖師麻-甘草配伍治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎機(jī)制之一。
　　采用大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)模型初步考察了甘草提取物對(duì)祖師麻中瑞香素藥代動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)的影響，以及甘草中主要活性成分甘草酸、甘草苷對(duì)瑞香素藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，初步探索其配伍用藥的合理性。將大鼠分別灌胃祖師麻提取物、祖師麻-甘草提取物、瑞香素、瑞香素與甘草酸混合物及瑞香素與甘草苷混合物后，不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣，UPLC-MS-MS分析測(cè)定血漿

6、中瑞香素濃度，建立藥物濃度-時(shí)間曲線，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS3.2.4軟件計(jì)算分析。結(jié)果表明，甘草提取物能夠顯著增加祖師麻中瑞香素的AUC、Tmax，降低CL;甘草酸配伍瑞香素后，對(duì)瑞香素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)明顯影響，甘草苷配伍瑞香素，能夠增大瑞香素的AUC、Cmax、Tmax，降低瑞香素CL與MRT。因此得出結(jié)論，甘草提取物能夠顯著增加祖師麻中瑞香素的生物利用度，可能與其黃酮類主要活性成分甘草苷有關(guān)。對(duì)此本課題采用Caco-2細(xì)胞吸收模型及體外

7、肝微粒體代謝模型研究甘草及其主要活性成分對(duì)祖師麻中瑞香素吸收與代謝環(huán)節(jié)的影響。
　　采用Caco-2單層細(xì)胞模型研究甘草提取物對(duì)祖師麻中瑞香素吸收的影響。數(shù)據(jù)表明，甘草提取物對(duì)瑞香素在Caco-2單層細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有顯著影響，祖師麻組及祖師麻-甘草組中瑞香素的Papp值沒(méi)有顯著差異，提示甘草提取物對(duì)祖師麻中瑞香素在小腸上皮細(xì)胞吸收影響可能不顯著。
　　采用體外肝微粒體模型研究甘草及其主要活性成分對(duì)祖師麻中瑞香素代謝的影響。

8、祖師麻提取物組與祖師麻-甘草提取物組經(jīng)肝微粒體系統(tǒng)代謝后，使用HPLC分析測(cè)定瑞香素的剩余量，后者與前者相比明顯提高，說(shuō)明甘草能夠通過(guò)影響肝臟中的代謝酶，從而明顯抑制祖師麻中瑞香素的代謝，增加瑞香素在體內(nèi)的血藥濃度，從而使祖師麻-甘草提取物中瑞香素的生物利用度明顯大于祖師麻提取物中瑞香素的生物利用度。
　　不同濃度甘草中主要活性成分，如甘草酸及其代謝產(chǎn)物甘草次酸，甘草苷及其代謝產(chǎn)物甘草素對(duì)瑞香素在肝微粒體中代謝影響研究結(jié)果表明，瑞

9、香素+甘草酸、瑞香素+甘草次酸、瑞香素+甘草苷、瑞香素+甘草素經(jīng)肝微粒體Ⅰ相孵育系統(tǒng)代謝后，說(shuō)明甘草提取物中的主要成分對(duì)瑞香素在肝微粒體Ⅰ相代謝沒(méi)有顯著影響作用，僅瑞香素+甘草次酸高劑量組與瑞香素+甘草素高劑量組中剩余的瑞香素藥量與對(duì)照組，顯著增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;經(jīng)肝微粒體Ⅱ相孵育系統(tǒng)代謝后，瑞香素+甘草酸組，瑞香素+甘草苷及瑞香素+甘草素組中瑞香素剩余藥量與對(duì)照組相比明顯增加，瑞香素+甘草次酸組中瑞香素剩余藥量與對(duì)照組相比明顯降低，說(shuō)

10、明甘草酸、甘草苷及甘草素對(duì)瑞香素在肝微粒體中的Ⅱ相代謝有一定抑制作用，而甘草酸代謝產(chǎn)物甘草次酸對(duì)瑞香素在肝微粒體中的Ⅱ相代謝有一定促進(jìn)作用。
　　本課題采用整體動(dòng)物模型，從藥效學(xué)角度闡明甘草協(xié)同祖師麻治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的配伍機(jī)制，并篩選其最佳配伍比例;同時(shí)采用大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、Caco-2細(xì)胞模型及體外肝微粒體代謝模型等多種藥代動(dòng)力學(xué)模型，以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶為切入點(diǎn)，從吸收、代謝途徑較為完整地闡述甘草協(xié)同祖師麻治療類風(fēng)濕性關(guān)

11、節(jié)炎的協(xié)同增效機(jī)制，采用多角度、多生物模型，較為全面的揭示和探討了甘草提取物及其主要活性成分對(duì)祖師麻中瑞香素吸收、代謝的影響，并初步闡明了其作用機(jī)理，綜合說(shuō)明了甘草配伍后瑞香素體內(nèi)生物利用度提高的原因，為甘草協(xié)同祖師麻的合理性提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。
　　本課題的研究為祖師麻-甘草復(fù)方的開發(fā)打下了基礎(chǔ)，并探討其可能作用的機(jī)制，以期開發(fā)成為新藥。本課題也同時(shí)為中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)的體內(nèi)過(guò)程研究提供了新思路和新方法，特別是為復(fù)方體內(nèi)過(guò)程研究提