重力矢量及趨化誘導(dǎo)對脂肪干細(xì)胞在PLGA電紡膜上早期黏附增殖的影響.pdf

1、目的：
　　以體外原代培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ASCs）為研究對象，觀察不同重力矢量條件，以及血小板衍生生長因子(Platelet-derived growthfactor, PDGF)影響下，ASCs在PLGA電紡膜表面的黏附定植情況。探討重力因素和趨化因子對于細(xì)胞在組織工程支架上的黏附定植和增殖功能活動的影響及其二者之間的相互作用。
　　材料和方法：
　　1、PLGA

2、電紡膜制備以24 ml三氯甲烷(Trichloromethane，TCM，分析純)和6 ml N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF，分析純)按體積比8∶2混合，將5.4 g聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA，固有粘度0.76 dl/g，重均分子量80，000 Da)與之溶解混合成18％質(zhì)量體積比電紡溶液。在推射速率1 ml/h、場電壓14 KV、

3、噴射距離12 cm條件下，靜電紡絲法制備PLGA電紡膜。成品厚度約為600μm，最大可利用面積約26.0×19.0 cm2，密度約為0.172 g/cm3，質(zhì)量為5.4 g。PLGA電紡膜裁剪為直徑4.5 mm圓形試件后密封，鉆-60輻射消毒24 h（累積放射劑量25K Gy）后保存待用。
　　2、ASCs提取無菌條件下提取新鮮的面部輪廓整形手術(shù)所切取的人頰脂墊脂肪組織10ml，剪碎為1 mm3體積的顆粒，以Ⅰ型膠原酶消化，離心法

4、獲得ASCs，加入完全DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％二氧化碳、飽和濕度條件下原代培養(yǎng)至第14天時(shí)，對培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞以0.25％胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，每3天換液，達(dá)到80％融合時(shí)傳代。ASCs傳至第5代(Passage Five，P5)時(shí)，-80℃冰箱冷凍保存。
　　3、實(shí)驗(yàn)分組常規(guī)復(fù)蘇課題組前期凍存的P5 ASCs。復(fù)蘇后每3天換液，達(dá)到80％融合時(shí)傳代。取生長良好的P6 ASCs，0.25％胰蛋白酶消化，在DMEM培養(yǎng)液內(nèi)調(diào)整

5、細(xì)胞計(jì)數(shù)至3×104/ml。將該ASCs細(xì)胞懸液按100μl/孔（細(xì)胞數(shù)量3000）依次加入96孔板。依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為四組，每組3孔:(1) PDGF/重力矢量(+)組:用微量加樣槍滴加1μl含0.01 ng PDGF的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）至PLGA電紡膜上，置于培養(yǎng)孔底，細(xì)胞懸液鋪于PLGA電紡膜之上;(2) PBS/重力矢量(+)組:滴加1μl空白PBS至PLGA電紡膜上，置于培

6、養(yǎng)孔底，細(xì)胞懸液鋪于PLGA電紡膜上;(3) PDGF/重力矢量（-）組:用微量加樣槍滴加1μl含0.01 ng PDGF的PBS至PLGA電紡膜上，將膜覆蓋于培養(yǎng)孔細(xì)胞懸液上方;(4) PBS/重力矢量（-）組:用微量加樣槍滴加1μl空白PBS至PLGA電紡膜上，將膜覆蓋于培養(yǎng)孔細(xì)胞懸液上方。
　　4、檢測分析將96孔板置于37℃、5％二氧化碳、飽和濕度條件下培養(yǎng)，分別于第0，1，3，5，8，11天同一時(shí)間點(diǎn)，每組取3孔，加入1

7、0μlAlamar Blue試劑，繼續(xù)孵化。24 h后在570 nm和600 nm波長條件下測定細(xì)胞懸液內(nèi)的OD值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組PLGA電紡膜上定植ASCs的相對數(shù)量及其增殖功能活動情況。分析PDGF趨化吸引對于ASCs在PLGA電紡膜上黏附的趨化作用，以及重力因素與該趨化作用之間的相互影響。進(jìn)一步探討對于具有一定體積和三維空間結(jié)構(gòu)的組織工程支架，上述因素可能產(chǎn)生的影響作用。
　　實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS20.0軟件，進(jìn)行

8、重復(fù)測量的三因素一元方差分析，以P＜0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1、針對重力矢量方向的影響作用，在添加PDGF的實(shí)驗(yàn)組，重力矢量(+)組在第1、2、4、6、9、12天的Alamar Blue下降百分?jǐn)?shù)均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)重力矢量（-）組。顯示重力矢量方向?qū)?xì)胞在支架材料表面的黏附及進(jìn)一步的增殖活動產(chǎn)生明顯的影響，并且貫穿實(shí)驗(yàn)始終。
　　而在添加空白PBS的對照組，也呈現(xiàn)類似的結(jié)果。說明有利的重力矢量方向是

9、對ASCs的黏附定植和增殖產(chǎn)生決定性影響的因素。
　　2、針對PDGF的趨化誘導(dǎo)作用，在重力矢量(+)條件下，添加PDGF實(shí)驗(yàn)組的Alamar Blue在第1、2、4天的下降百分?jǐn)?shù)與同一時(shí)間點(diǎn)添加PBS對照組無明顯差別，但第6、9、12天的下降百分?jǐn)?shù)明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)添加PBS的對照組。提示在重力矢量有利的環(huán)境中，趨化吸引并不對ASCs早期的黏附和定植具有明顯影響;一旦ASCs進(jìn)入快速增殖期，趨化因子可具有顯著促進(jìn)作用。
　

10、　在重力矢量（-）條件下，添加PDGF實(shí)驗(yàn)組第1、2、4、6、9、12天的下降百分?jǐn)?shù)明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)添加PBS的對照組。說明在重力矢量方向不利的環(huán)境中，趨化誘導(dǎo)效應(yīng)能部分抵消不利影響，促進(jìn)ASCs黏附定植與增殖。
　　3、相對ASCs在PLGA電紡膜上增殖活動的時(shí)間-空間變化趨勢而言，隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間間期延長，可見各組ASCs增殖活動明顯提高，且各時(shí)間點(diǎn)之間具有顯著性差異;結(jié)果提示，ASCs在支架上黏附定植后，均有明顯的增殖活動。在同

11、一時(shí)間點(diǎn)（第6，9，12天）橫向?qū)Ρ?，各組ASCs的增殖活動水平亦具有顯著性差異;提示重力矢量方向和PDGF趨化吸引作用，均對細(xì)胞在組織工程支架上的黏附與增殪具有明顯影響，二者具有交互效應(yīng)，并隨時(shí)間延長對ASCs的增殖疊加影響，各實(shí)驗(yàn)組間產(chǎn)生顯著性差異。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，隨實(shí)驗(yàn)間期延長，采取有利的重力矢量方向以及PDGF趨化誘導(dǎo)組的ASCs在支架上的黏附定植和增殖呈現(xiàn)出相對于其他各組明顯的優(yōu)勢。
　　結(jié)論：
　　1、靜

12、電紡絲制備的PLGA電紡膜，孔隙率高，纖維交織構(gòu)成疏松多孔結(jié)構(gòu)，近似細(xì)胞間質(zhì)的支架作用，有利于ASCs種子細(xì)胞黏附定植及增殖。
　　2、細(xì)胞因子PDGF具有明顯誘導(dǎo)ASCs趨化聚集作用，能顯著改善ASCs在PLGA電紡膜支架上的黏附與增殖。
　　3、重力矢量因素對于ASCs在PLGA電紡膜上的黏附定植與增殖功能活動具有顯著影響，有利的重力矢量方向是對ASCs的黏附定植和增殖產(chǎn)生決定性影響的因素。
　　4、重力矢量方向和