HBxAg對S100A11的轉錄調控及S100A11對肝癌BEL-7402細胞增殖的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是慢性肝炎的重要病原之一，常導致嚴重肝病，包括肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcmoma，HCC)。在HCC形成過程中，其中HBxAg(hepatitis B x antigen)的功能一直是研究熱。在轉錄水平HBxAg對病毒本身及人類多種基因具有激活及阻遏作用。S100A11蛋白廣泛存在于正常人體組織細胞中，該蛋白進入細胞核發(fā)揮細胞生長負調節(jié)作用。在某些腫

2、瘤細胞中S100A11蛋白的表達量升高。而增多的S100A11蛋白從腫瘤細胞的細胞核移位至細胞質?！坝郎奔毎械倪@種蛋白定位改變可能使其喪失本身的生物學功能。 目的： 本課題旨在研究S100A11蛋白在肝癌細胞系BEL-7402增殖過程中發(fā)揮的作用，以及明確該蛋白在正常肝細胞、慢性HBV感染的肝細胞及肝癌細胞中的核質定位分布特點，進一步探討HBxAg對S100A11基因在轉錄水平的調節(jié)作用。 方法：

3、1．構建S100A11的真核表達載體(實驗組)，同時設平行對照，轉染肝癌細胞系BEL-7402，篩選穩(wěn)定表達。通過流式細胞術檢測肝癌細胞BEL-7402中處于細胞分裂各周期中的相對細胞數(shù)，分析含目的基因質粒組及相應對照組中處于分裂周期中S期的細胞數(shù)。采用活細胞發(fā)光法檢測兩組細胞中活細胞數(shù)量相對值，繪制細胞生長曲線并進行比較。 2．構建HBxAg的真核表達載體及S100A11-promoter熒光素報告質粒，并設平行對照，轉染BE

4、L-7402。制備轉染后的細胞裂解液，在肝癌BEL-7402細胞中檢測HBxAg對S100A11啟動子轉錄活性的影響。用Luciferase法檢測報告基因表達。 3．通過免疫組織化學技術比較S100A11蛋白在正常肝細胞、慢性HBV感染的肝細胞以及肝癌細胞中的分布情況。構建S100A11綠色熒光素質粒，瞬時轉染肝癌細胞系BEL-7402，通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白在BEL-7402中的分布。 結果： 1．實驗組B

5、EL-7402細胞經流式細胞術檢測后發(fā)現(xiàn)處于S期的細胞占26.49±1.94％；而平行對照組中處于S期的細胞占30.42±1.62％；野生株BEL-7402中處于細胞分裂周期中S期的細胞占總細胞數(shù)的31.40±2.06％。均分細胞后，用活細胞發(fā)光法檢測細胞增殖情況。 結果顯示，36h檢測時實驗組細胞增殖速率與對照組相比明顯降低。 2．本實驗成功獲得含人S100A11基因啟動子的熒光素報告載體，且測序證實插入序列與理論序列

6、一致。實驗組的轉錄活性與對照組的轉錄活性相比降低60％。 3．免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞胞質中S100A11蛋白的量較正常細胞明顯增多，慢性乙型肝炎中S100A11蛋白的表達量微弱。而我們強制表達的外源性S100A11蛋白在BEL-7402細胞的細胞核及細胞質中均有分布。 結論： 1．S100A11對肝癌細胞BEL-7402具有明顯的生長抑制作用，主要表現(xiàn)為使處于細胞分裂周期中S期細胞數(shù)量明顯減少。