白細胞介素28、P21活化激酶4基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎病人抗病毒應答的關聯性分析.pdf

1、全世界約1/3人口曾經或正存在乙型肝炎病毒的血清學表現，3.5-4億乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)攜帶者。乙型肝炎的疾病譜和自然史多種多樣，從非活動性病毒攜帶狀態(tài)至進行性加重不等，重者發(fā)展為肝硬化(livercirrhosis，LC)和肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)。在亞洲，有40％的慢性乙型肝炎病人(chronichepatitisB，CHB)死于肝硬化或肝細胞癌。
　

2、　 乙型肝炎的遺傳易感性和對治療的應答體現在HBV與宿主基因組之間的長期共進化作用，這種進化是以人群中DNA分子的多態(tài)性為基礎的。因此，運用遺傳流行病學和分子流行病學的研究方法，確定和HBV感染后抗病毒治療應答相關的易感基因和易感位點，對乙型肝炎個體化防治具有重要意義。
　　 白細胞介素28(IL-28)細胞因子，又稱IFN-λ，分2個亞型，IL-28A和IL-28B，在抗病毒過程中起到免疫防御作用，P21活化蛋白激酶4(PA

3、K4)位于IL-28B基因上游64kb處，屬于P21活化蛋白激酶家族，Rac和Cdc42的效應蛋白。它是肌動蛋白細胞支架、神經軸突生長、細胞存活、激素信號系統(tǒng)和基因轉錄的重要調節(jié)器，PAK4特向作用于三磷酸鳥苷(GTP)形成GTP結合蛋白Cdc42Hs并且微弱作用于MAP激酶(mitogen-activatedprotein)的c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)家族，參與絲狀偽足形成的調節(jié)，在肌

4、動蛋白細胞骨架重組中起著一定作用。前期全基因組關聯研究(genome-wideassociationstudy，GWAS)在美國、澳大利亞和日本分別證實分屬IFN-λ家族的細胞因子IL28B附近的基因突變與丙型肝炎病毒感染后轉歸和治療應答有關。IL28及其附近的PAK4基因多態(tài)性是否與中國漢族人群乙型肝炎病毒感染后抗病毒治療應答有關目前很有爭議。
　　 本研究擬采用分子流行病學病例對照研究設計，Hapmap數據庫篩選出可能會影響

5、HBV感染后抗病毒治療應答的單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MatrixAssistedLaserDesorption/ionizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS)技術對目標基因位點分型，分析基因型與慢性乙型肝炎的關系，探討IL28、PAK4的基因多態(tài)性對中國漢族慢性乙型肝炎病人抗病毒治療應答的

6、影響，以期為臨床個體化治療和預后提供依據。
　　 第一部分:白細胞介素28基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎病人拉米夫定治療應答的關系
　　 目的:本研究選擇白細胞介素28A基因（interleukin28A，IL28A，IFN-λ2）、白細胞介素28B基因（interleukin28B，IL28B，IFN-λ3)為候選基因，選取rs8099917和rs12980602兩個位點分析宿主遺傳因素與慢性乙型肝炎拉米夫定治療應答的關系。

7、
　　 方法:354例首次應用拉米夫定治療的慢性乙型肝炎患者作為研究對象，以調查問卷形式收集研究對象的基線資料、發(fā)病情況、檢查結果，并在拉米夫定治療1年時對病人的HBeAg血清轉換情況、HBVDNA病毒載量及ALT復常情況進行跟蹤隨訪。完全應答定義為HBe抗原轉陰、HBVDNA檢測不到或低于檢測下限，或較基線下降≥2log10、ALT水平下降至正常;部分應答定義為HBVDNA檢測不到或低于檢測下限，或較基線下降≥2log10、A

8、LT水平下降至正常;不符合上述標準者定義為非應答。
　　 利用CNKI和Pubmed查詢免疫疾病易感基因和與治療應答相關的文獻，用Hapmap在中國漢族人群選擇待研究基因的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)位點，Haploview軟件排除呈高度連鎖不平衡（linkagedisequilibrium，LD）的位點。
　　 收集外周血，采用血液基因組DNA提取試劑盒從抗凝全

9、血提取DNA。運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MatrixAssistedLaserDesorption/ionizationTimeofFlightMassSpectrometry,MALDI-TOFMS)的實驗平臺對候選基因:IL28B-rs8099917(TT、GT、GG)，IL28A-rs12980602(TT、CT、CC)進行DNA的SNPs分型。
　　 采用SPSS16.0進行數據處理和分析，對181例拉米夫定

10、治療應答組和173例非應答組計量資料兩兩比較用獨立樣本的t檢驗，單因素計數資料比較采用卡方檢驗，以非條件Logistic回歸校正混雜因素并計算比值比(oddsratio，OR)和95％置信區(qū)間(95％confidenceintervals，95％CI)，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計檢驗均為雙側。
　　 結果:
　　 1.位點連鎖不平衡
　　 用Haploview軟件證實rs8099917和rs1298060

11、2不存在連鎖不平衡，選擇的2個位點等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＞0.05)，不存在連鎖不平衡，說明研究樣本具有群體代表性。
　　 2.應答組和非應答組患者基線特征的比較
　　 應答組中男性、吸煙和飲酒者所占的比例均低于非應答組(61.33％vs76.30％,P=0.002;29.83％vs43.35％,P=0.008;38.67％vs52.02％,P=0.012），證明性別、吸煙、飲酒是拉

12、米夫定治療應答的獨立影響因素，男性患者、有吸煙飲酒史的患者更不容易實現治療應答。年齡、HBVDNA和ALT水平在兩組間均無統(tǒng)計學差異(50.86±11.03vs52.22±10.82;7.67logcopies/mlvs7.69logcopies/ml;279.50IU/Lvs317.50IU/L;P＞0.05)。將纖維化程度分為f0-f4，與拉米夫定的治療應答呈顯著負相關，OR值為0.716(95％CI=0.432-0.986)，P=

13、0.036，纖維化程度越高，治療應答率越低。
　　 3.rs8099917位點與拉米夫定治療應答的關系
　　 對rs8099917基因位點檢測結果發(fā)現，TT為其顯性基因，無論在應答組還是非應答組未發(fā)現GG基因型，單因素分析應答組突變基因型GT攜帶率明顯高于非應答組(8.8％vs2.3％)，OR值為4.097(95％CI=1.342-12.512，P=0.015)。在多因素分析中，當校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、HBVDN

14、A，ALT基線水平后，IL-28Brs8099917位點的突變基因型GT仍顯示與拉米夫定治療的高應答有關，OR值為4.025(95％CI=1.316-12.354)，P=0.013。攜帶rs8099917GT基因型者可能預示著拉米夫定治療的成功。
　　 4.rs12980602位點與拉米夫定治療應答的關系
　　 對rs12980602基因位點檢測的結果與rs8099917相似，TT也是其顯性基因。單因素分析應答組突變基因

15、型CT和CC攜帶率明顯高于非應答組(18.8％vs9.2％),OR值為2.27(95％CI=1.202-4.284);P=0.014)。但在多因素分析中，當校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、HBVDNA，ALT基線水平后，IL-28Brs12980602位點的突變基因型CT和CC顯示與拉米夫定治療應答無相關性，OR值為1.765(95％CI=0.884-3.617，P=0.109)。
　　 結論:
　　 1.用Haplovi

16、ew軟件證實rs8099917位點和rs12980602位點不存在連鎖不平衡，說明研究樣本具有群體代表性。
　　 2.性別、吸煙、飲酒是拉米夫定治療應答的獨立影響因素，男性患者、有吸煙飲酒史的患者不容易實現治療應答。
　　 3.白細胞介素28基因的rs8099917和rs12980602兩個位點基因多態(tài)性與HBeAg陽性慢性乙型肝炎病人拉米夫定治療應答有關聯，攜帶rs8099917位點突變基因型GT，rs12980602

17、位點突變基因型CT和CC者可能預示著拉米夫定治療的成功，尤其以rs8099917位點突變基因型GT為生物學標志。
　　 4.肝纖維化早期預示著對拉米夫定治療的高應答。
　　 第二部分:白細胞介素28、P21活化激酶4基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干擾素治療應答的關系
　　 目的:聚乙二醇干擾素治療費用昂貴且治療有一定的副作用，所以高應答率病人的選擇對臨床合理用藥來說非常必要。本研究選擇IL28A(IFN-λ

18、2)、IL28B（IFN-λ3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4基因(p21_activatedkinases4，PAK4)為候選基因，選取rs8099917、rs12980602和rs9676717三個位點分析宿主遺傳因素與慢性乙型肝炎聚乙二醇干擾素治療應答的關系。
　　 方法:240例首次應用聚乙二醇干擾素治療的慢性乙型肝炎患者作為研究對象，以調查問卷形式收集研究對象的基線資料、發(fā)病情況、檢查結果，并在聚乙二醇干擾素治療6月時對病

19、人的HBeAg血清轉換情況、HBVDNA病毒載量及ALT復常情況進行跟蹤隨訪。完全應答定義為HBe抗原轉陰、HBVDNA檢測不到或低于檢測下限，或較基線下降≥2log10、ALT水平下降至正常;部分應答定義為HBVDNA檢測不到或低于檢測下限，或較基線下降≥2log10、ALT水平下降至正常;不符合上述標準者定義為非應答。
　　 利用CNKI和Pubmed查詢免疫疾病易感基因和與治療應答相關的文獻，用Hapmap在中國漢族人群選

20、擇待研究基因的單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）位點，Haploview軟件排除呈高度連鎖不平衡(linkagedisequilibrium，LD)的位點。
　　 收集外周血，采用血液基因組DNA提取試劑盒從抗凝全血提取DNA。運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MatrixAssistedLaserDesorption/ionizationTimeofFlightMassS

21、pectrometry,MALDI-TOFMS)的實驗平臺對候選基因:IL28B-rs8099917(TT、GT、GG)，IL28A-rs12980602(TT、CT、CC),PAK4-rs9676717(TT、CT、CC)進行DNA的SNPs分型。
　　 采用SPSS16.0進行數據處理和分析，比較92例聚乙二醇干擾素治療應答組和148例非應答組計量資料兩兩比較用獨立樣本的t檢驗，單因素計數資料比較采用卡方檢驗，以非條件Log

22、istic回歸校正混雜因素并計算比值比(oddsratio，OR)和95％置信區(qū)間(95％confidenceintervals，95％CI)，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計檢驗均為雙側。
　　 結果:
　　 1.位點連鎖不平衡
　　 用Haploview軟件證實rs8099917、rs12980602和rs9676717不存在連鎖不平衡，選擇的3個位點等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律

23、(P＞0.05)，不存在連鎖不平衡，說明研究樣本具有群體代表性。
　　 2.應答組和非應答組患者基線特征的比較
　　 應答組飲酒者占36.96％，明顯低于非應答組的50％(P=0.048)，飲酒是聚乙二醇干擾素治療應答的獨立影響因素，有飲酒史的患者不容易實現治療應答。年齡、男性所占比例、吸煙者所占比例、HBVDNA和ALT基線水平在兩組間均無統(tǒng)計學差異（38.07±14.62vs37.3±12.67;67.39％vs66

24、.22％;41.30％vs51.35％;7.67logcopies/mlvs7.69logcopies/ml;279.50IU/Lvs317.50IU/L;P＞0.05)。
　　 3.rs8099917位點與聚乙二醇干擾素治療應答的關系
　　 對rs8099917基因位點檢測結果表明，TT為其顯性基因，應答組無GG基因型，應答組和非應答組TT、GT和GG基因型的攜帶率無統(tǒng)計學差異(89.13％，10.87％，0.00％v

25、s87.84％，9.46％，2.70％，P=0.838)。rs8099917位點與聚乙二醇干擾素治療后6月的應答關聯性分析結果表明，兩者間沒有明顯的關聯性，單因素分析OR值為0.881(95％CI=0.388-2.002)，P=0.838;多因素分析校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、HBVDNA，ALT水平后，OR值為0.881(95％CI=0.388-2.002)，P=0.999。
　　 4.rs12980602位點與與聚乙二醇干

26、擾素治療應答的關系
　　 對rs12980602位點檢測的結果與rs8099917位點相似，TT也是其顯性基因，應答組和非應答組TT、CT和CC基因型的攜帶率無統(tǒng)計學差異(82.61％,15.22％,2.17％vs81.08％,18.92％,0.00％，P=0.186)。rs12980602位點與聚乙二醇干擾素治療后6月的應答關聯性分析結果表明，兩者間沒有明顯的關聯性，單因素分析OR值為0.902(95％CI=0.458-1.7

27、78)，P=0.766;多因素分析校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、HBVDNA，ALT水平后，OR值為0.688(95％CI=0.311-1.523)，P=0.356。
　　 5.rs9676717位點與與聚乙二醇干擾素治療應答的關系
　　 對rs9676717位點檢測結果表明，應答組與非應答組TT、CT和CC基因型的攜帶率有顯著統(tǒng)計學差異(56.52％，32.61％，10.87％vs40.54％，52.70％，6.76％

28、，P=0.009)。單因素分析rs9676717位點攜帶突變基因型CT+CC與干擾素治療后的應答有顯著的負相關性，OR值為0.524(95％CI=0.310-0.888)，P=0.016。當多因素分析校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、HBVDNA，ALT水平后，PAK4基因的rs9676717位點的突變基因型CT+CC仍顯示與干擾素治療應答呈負相關，OR值為0.173(95％CI=0.037-0.799);P=0.025。
　　 結

29、論:
　　 1.飲酒是聚乙二醇干擾素治療應答的獨立影響因素，有飲酒史的慢性乙型肝炎患者不容易實現治療應答。
　　 2.位于IL-28的rs8099917和rs12980602位點與慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干擾素治療的應答率無關，而攜帶PAK4的突變基因型CT+CC降低干醇干擾素治療的應答率無關，而攜帶PAK4的突變基因型CT+CC降低干擾素治療6月患者的應答。
　　 第三部分:IL-28B基因型與乙型肝炎病毒感染

30、后病毒自發(fā)清除及干擾素治療應答關系的Meta分析
　　 目的:采用Meta分析的方法，對國內外在不同人群不同類別乙型肝炎患者中開展的研究結果進行綜合評價，評價IL-28B基因rs12979860位點及rs8099917位點與HBV感染后病毒自發(fā)清除及治療應答的相關性。
　　 方法:利用關鍵詞“IL-28B、SNP、hepatitisB、spontaneousclearance、treatmentandinterferon

31、¨聯合檢索PUBMED、MEDLINE、EMBASE、Cochranelibrary數據庫、中國萬方數據庫、中文科技期刊全文數據庫、中國生物醫(yī)學文獻數據庫、中國學術期刊全文數據庫的中英文文獻。末次檢索日期是2013年3月25日。共檢索到32篇文獻。由兩位研究人員對檢索到的所有文獻題目和摘要進行評估篩選，最后選出5篇關于rs12979860位點與HBV感染后自發(fā)清除的相關文獻、7篇關于rs12979860位點與HBV感染后干擾素治療應答的

32、文獻、3篇關于rs8099917位點與HBV感染后自發(fā)清除的相關文獻、3篇關于rs8099917位點與HBV感染后干擾素治療應答的文獻。納入Meta分析提取納入文獻的信息如下:第一作者、出版年、研究設計類型、受試者來自的國家和種族、乙型肝炎診斷類型、病例組和對照組的定義和數量、提取DNA和分型的方法、病毒亞型、治療方法等。文獻未提供基因型的，利用相應的基因頻率計算，分別提取rs12979860位點及rs8099917位點的相關數據，對兩

33、個位點的顯性模型進行了Meta分析。計算優(yōu)勢比(OR)及其95％CI作為效應量。首先對納入分析的原始文獻進行Q檢驗，分析異質性，根據異質性檢驗結果，選擇固定效應模型或隨機效應模型求其效應合并值。用漏斗圖和Begg's檢驗進行發(fā)表偏倚分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有數據用STATA11.1分析。
　　 結果:
　　 1.rs12979860位點與乙型肝炎病毒感染后病毒自發(fā)清除的關系共有5篇符合分析條件的關于rs

34、12979860位點與HBV感染后自發(fā)清除的相關文獻。Meta分析的異質性檢驗顯示:各研究間不存在異質性(I2=20.0％，P=0.287)。根據異質性檢驗結果選擇M-H固定效應模型對rs12979860位點顯性模型(TC+CCvsCC)進行數據合并，結果顯示，合并后的OR為1.05(95％CI:0.83-1.32，P=0.70)，證明rs12979860位點與乙型肝炎病毒感染后病毒自發(fā)清除沒有關聯。Begg's偏倚分析顯示無明顯發(fā)表偏

35、倚，P＞0.1。
　　 2.rs12979860位點與乙型肝炎病毒感染后治療應答的關系
　　 有7篇符合分析條件的關于rs12979860位點與乙型肝炎病毒感染后治療應答關系的相關文獻。Meta分析的異質性檢驗顯示:合并后的OR為1.57(95％CI:1.06-2.33，P=0.024)但各研究間存在異質性(I2=61.6％，P=0.016)。根據異質性檢驗結果對數據進行分層分析，按照乙型肝炎病人診斷類別分HBeAg陽性

36、組和HBeAg陰性組進行分析。HBeAg陽性組的4篇文獻仍然存在異質性(I2=77.7％，P=0.004)，采用隨機效應模型分析結果如下:rs12979860位點顯性模型(TC+TTvsCC)合并后的OR為0.717(95％CI:0.190-2.701，P=0.623)，證明rs12979860位點與HBeAg陽性慢性乙型肝炎病毒感染后干擾素治療應答沒有關聯。HBeAg陰性組3篇文獻采用固定效應模型分析結果如下:各研究間不存在異質性(I

37、2=0.0％，P=0.710)。根據異質性檢驗結果對rs12979860位點顯性模型(TC+TTvsCC)選擇M-H固定效應模型進行數據合并，結果顯示，合并后的OR為2.132(95％CI:1.15-3.95，P=0.016)，rs12979860位點與乙型肝炎病毒感染后治療應答呈正相關，突變基因型TC+TT顯著提高HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者對干擾素治療的應答率。無發(fā)表偏倚。
　　 3.rs8099917位點與乙型肝炎病毒感

38、染后病毒自發(fā)清除的關系
　　 共有3篇符合分析條件的關于rs8099917位點與HBV感染后自發(fā)清除的相關文獻。Meta分析的異質性檢驗顯示:各研究間不存在異質性(I2=0.0％，P=0.705)。根據異質性檢驗結果對rs8099917位點顯性模型(GG+GTvsTT)選擇M-H固定效應模型進行數據合并，結果顯示，合并后的OR為1.084(95％CI:0.72-1.623，P=0.696)，證明rs8099917位點與乙型肝炎病

39、毒感染后病毒自發(fā)清除沒有關聯。無發(fā)表偏倚。
　　 4.rs8099917位點與乙型肝炎病毒感染后治療應答的關系
　　 有3篇符合分析條件的關于rs8099917位點與乙型肝炎病毒感染后治療應答關系的相關文獻。對rs8099917位點顯性模型(GG+GTvsTT)Meta分析的異質性檢驗顯示:合并后的OR為0.400(95％CI:0.24-0.66，P=0.000)，證明rs8099917位點與乙型肝炎病毒感染后治療應答呈

40、負相關，突變基因型GG+GT顯著降低慢性乙型肝炎患者對干擾素治療的應答率。各研究間不存在異質性(I2=36.8％，P=0.206)，無發(fā)表偏倚。
　　 結論:
　　 1.通過Meta分析證實，IL28Brs12979860位點基因型與乙型肝炎病毒感染后病毒自發(fā)清除以及HBeAg陽性慢性乙型肝炎病人干擾素治療應答無關，與HBeAg陰性慢性乙型肝炎病人干擾素治療應答存在一定的相關性。IL28Brs12979860位點基因型與

41、乙型肝炎病毒感染后病毒自發(fā)清除以及HBeAg陽性慢性乙型肝炎病人干擾素治療應答無關，與HBeAg陰性慢乙肝病人干擾素治療應答呈正相關，以野生型等位基因C為參照，突變基因型TC+TT顯著提高HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者對干擾素治療的應答率。
　　 2.通過Meta分析證實，IL28Brs8099917位點基因型與乙型肝炎病毒感染后病毒自發(fā)清除無關，與乙型肝炎病毒感染后治療應答呈負相關，突變基因型GG+GT顯著降低慢性乙型肝炎患者