小分子RNA干擾Cx37對動脈粥樣斑塊的影響.pdf

1、目前，冠心病成為全球范圍內(nèi)影響人類壽命的重大問題，國內(nèi)外專家對冠心病的關(guān)注程度日益增加。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，也是一種復(fù)雜的多因素疾病。有研究表明，遺傳因素貫穿于動脈粥樣硬化的始終。基因的變化可能在AS斑塊的進(jìn)展和/或失穩(wěn)中起重要作用。遺傳流行病學(xué)研究也顯示遺傳因素在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生、發(fā)展中有重要意義。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，從基因方面闡明冠狀動脈粥樣硬化性

2、心臟病的發(fā)生將為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的診治開辟一個(gè)新領(lǐng)域。既往我們的調(diào)查表明間隙性連接蛋白37(Connexin37) C1019T基因多態(tài)性與冠心病有顯著相關(guān)性，而且在男性人群中更為明顯，同時(shí)在其他部位動脈粥樣硬化性疾病的研究中也提示存在相關(guān)性。但是，究竟是C等位基因還是T等位基因與冠心病相關(guān)目前有不同見解，這可能與樣本量含量大小、區(qū)域差異、臨床事件觀察終點(diǎn)的選擇（冠心病還是心肌梗死）等相關(guān)，Connexin37基因多態(tài)性與冠心病

3、的確切關(guān)系還有待大規(guī)模的病例對照研究、前瞻性研究加以證實(shí)。在發(fā)病機(jī)制方面，目前已明確的是:在早期動脈粥樣硬化斑塊形成階段，Connexin37基因多態(tài)性主要通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞黏附性來促進(jìn)斑塊形成，但在斑塊進(jìn)展期及斑塊破裂繼發(fā)血栓形成階段，Connexin37基因多態(tài)性具體分子作用還有待進(jìn)一步闡明。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)又稱基因沉默技術(shù)，能有效高選擇性地阻斷目的基因的表達(dá)，近期已經(jīng)廣泛地應(yīng)用

4、于體內(nèi)和體外基因功能的研究中。哺乳動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，化學(xué)合成的核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，或是質(zhì)?；虿《据d體介導(dǎo)的siRNA，均可促發(fā)基因沉默或者表達(dá)抑制?；虺聊夹g(shù)在細(xì)胞水平致病基因的功能研究中已廣泛應(yīng)用。借助于質(zhì)?；虿《据d體的介導(dǎo)，siRNA已經(jīng)被用于在體實(shí)驗(yàn)，高效降低靶基因的表達(dá)。在進(jìn)一步完善siRNA穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，RNAi的試劑有望應(yīng)用于臨床研究。
　　

5、目前國內(nèi)外對于Cx37基因在AS中的作用的研究才剛開始，Cx37基因在AS發(fā)展中可能具有重要的調(diào)控作用，我們設(shè)想應(yīng)用基因沉默技術(shù)干擾高脂飲食豬腹主動脈動脈斑塊Cx37表達(dá)，可能有助于阻止AS進(jìn)程，綜上所述，本研究分為三部分:
　　第一部分研究目的:構(gòu)建攜帶Cx37 siRNA慢病毒表達(dá)載體:根據(jù)Cx37基因設(shè)計(jì)siRNA相應(yīng)的DNA片段，分子克隆到BLOCK.It Lemiviral PolⅡ miRNAi表達(dá)載體，并驗(yàn)證Cx37

6、i體內(nèi)體外的基因沉默效應(yīng);選擇沉默最佳Cx37 siRNA。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，通過同源重組，生成攜帶有Cx37 siRNA的病毒懸液。
　　第二部分研究目的:通過高脂飲食建立豬動脈粥樣硬化模型。
　　第三部分研究目的:血管內(nèi)超聲檢測豬腹主動脈粥樣硬化斑塊，測量斑塊的體積斑塊性質(zhì)后，局部定位注射Cx37 siRNA病毒懸液，兩月后觀察Cx37 siRNA對AS進(jìn)程的影響。
　　1.材料與方法
　　1.1細(xì)胞

7、培養(yǎng)
　　HEK細(xì)胞系用先前報(bào)道的培養(yǎng)方法。所有細(xì)胞培養(yǎng)基都購自美國Gibco-BRL公司，HEK293細(xì)胞來自中國科學(xué)院的細(xì)胞庫。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。3條野生型Cx37干擾片段、陰性對照組和P3xflag-Cx37都是用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，與脂質(zhì)體2000按摩爾比率5∶1混合。
　　1.2慢病毒載體的制備與篩選RNA干擾靶點(diǎn)
　　首先，據(jù)基因庫中豬Cx37基因中設(shè)定3條RNA干

8、擾的靶序列（分別為A，B，C），靶序列mm-Cx37-1:5'GGUUAACGGUGCUCUUCAU3'定位:209，靶序列mm-Cx37-si-2:5'CCAAGGACCUACAUGUAGA3'定位:488，靶序列mm-Cx37-si-3:5'CAGACCCUUACCCUGAACA3'定位:841。P3xflag-Cx37和P3xflag作為對照組。
　　第二步，將3條RNA干擾序列和對照組序列通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，7

9、2小時(shí)后收集細(xì)胞，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌三次，吸取PBS殘留液體，加入含有蛋白酶抑制劑0.2ml的放射免疫溶菌緩沖劑，在冰上放置30分鐘，用細(xì)胞刮棒從離心管在冰上分離出細(xì)胞1.5ml，4℃下超聲溶解細(xì)胞30s，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后取上清液移至另一個(gè)干凈的微型離心管，置-20℃冰箱儲存。
　　第三步，用BCA測定蛋白濃聚物:使用96孔BCA蛋白含量測定試劑盒。A液與B液50∶1混合，在室溫下放置30分鐘后每孔加入200μL

10、，加入標(biāo)準(zhǔn)樣品牛血清白蛋白和10μL蛋白樣品（1∶10稀釋度），空白孔加入雙蒸餾水10uL調(diào)節(jié)至0，在37℃酶標(biāo)儀器里放置30分鐘后測定570nm吸光率，標(biāo)準(zhǔn)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所有蛋白樣品的濃聚度。
　　第四步，用Western blot法檢測siRNA干擾的有效性:10％ SDS-PAGE聚合物，每個(gè)樣品均量30ug;抗體標(biāo)志，4℃過夜孵化;GAPDH監(jiān)測樣本的表達(dá)量。標(biāo)志抗體∶家兔，1∶2000; GAPDH∶家兔，1∶1

11、0000抗體。所有細(xì)胞分為六組:實(shí)驗(yàn)組:過表達(dá)空質(zhì)粒組，Cx37質(zhì)粒，過表達(dá)Cx37重組質(zhì)粒，不同干擾片段。轉(zhuǎn)染試劑:脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑;質(zhì)粒:P3xflag，P3xflag-Cx37-0.4ug;干擾片段:50nM。轉(zhuǎn)染時(shí)間:72小時(shí)，根據(jù)Western blot結(jié)果篩選出最佳干擾片段。表達(dá)Cx37的慢病毒BLOCK制備—RNA干擾綠色熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)(GFP)(產(chǎn)品編號:K4948-00; Invitrogen)。將目前認(rèn)為與哺

12、乳動物基因無同源性的亂序siRNA(稱為mock-siRNA)作為對照組。
　　根據(jù)基因沉默分析結(jié)果，選擇siRNACx37 B，C片段進(jìn)行體外試驗(yàn)研究，以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW263.7為靶細(xì)胞將mock-LV、Cx372i，Cx373i的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)染五天后收集細(xì)胞進(jìn)，通過熒光定量RT-PCR、Western blot分別檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Cx37 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，篩

13、選出能有效阻斷Cx37基因表達(dá)的小分子干擾RNA載體。
　　1.3豬腹主動脈粥樣硬化模型建立
　　實(shí)驗(yàn)共60只雄性家豬，均同批次購自中國五指山，正常飲食，自由飲水。一周后接受高脂飲食（5％豬油，1％糖，3％膽固醇，0.2％丙硫氧嘧啶），一日三餐，持續(xù)十個(gè)月。
　　1.4豬腹主動脈血管造影和血管內(nèi)超聲(IVUS)分析
　　第8個(gè)月末，所有豬在麻醉后行腹主動脈血管造影和血管內(nèi)超聲檢查。所有IVUS圖像均由20-MHz

14、 Volcano Eagle Eye IVUS導(dǎo)管(Volcano Therapeutics Inc，.RanchoCordova，CA，USA)采集。辨別腹主動脈粥樣硬化斑塊后，IVUS導(dǎo)管通過該區(qū)域遠(yuǎn)端后以0.5毫米/秒的速度自動回撤?；爻啡淘赬線透視下監(jiān)測IVUS導(dǎo)管位置，利用IVUS成像記錄斑塊位置。為了獲得高質(zhì)量的圖片，在持續(xù)的心電監(jiān)護(hù)下每個(gè)動脈平均會撤兩次，根據(jù)圖片的分辨率和質(zhì)量選擇最好的一個(gè)循環(huán)圖像。IVUS虛擬組織學(xué)數(shù)

15、據(jù)記錄在硬盤，存檔后用于分析，分析以灰階圖為基礎(chǔ)。每個(gè)獨(dú)立圖片的組織圖分析由軟件提供支持（深綠色表示纖維組織，淺綠色代表纖維脂肪組織，紅色表示壞死的內(nèi)核，白色代表鈣化）。在檢測的全長血管中選擇20mm血管片段平均分為10段2mm長的小片段用于分析。在此之后，打開腹腔、左結(jié)腸旁溝和小網(wǎng)膜，從腹主動脈上游離降結(jié)腸及其系膜至右側(cè)，通過定位，短暫阻斷上游血流，切開主動脈斑塊，定位，30°方向進(jìn)針，隨機(jī)注射Cx37 siRNA病毒懸液、mock-

16、siRNA病毒懸液或生理鹽水。然后縫合血管及腹腔。所有豬均接受高脂飲食，Cx37 siRNA組，注射10μL Cx37慢病毒懸液。非治療組豬隨機(jī)分為mock-siRNA和鹽水亞組。Mock-siRNA注射10μLmock-siRNA，對照組注射不含病毒的生理鹽水。兩月后，所有豬接受腹主動脈造影和IVUS，分別用RT-PCR技術(shù)半定量測得Cx37 mRNA表達(dá)，Western-blot檢測Cx37蛋白表達(dá)量。所有用于本研究的動物均按照國際

17、衛(wèi)生組織指南規(guī)范使用。
　　1.5血脂水平及體重測定
　　在抽取眼靜脈竇血液，由無錫市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室用氧化酶法測定血脂水平，包括總膽固醇(TC)，甘油三脂(TG)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，測定時(shí)間分別為高脂飲食喂養(yǎng)前，喂養(yǎng)8個(gè)月（注入siRNA前），喂養(yǎng)10個(gè)月（實(shí)驗(yàn)結(jié)束）。同時(shí)間點(diǎn)測定體重。
　　2.數(shù)據(jù)分析
　　計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組間連續(xù)變量采用獨(dú)立t

18、檢驗(yàn)或方差分析。多組間變量比較采用ANOVA。所有檢驗(yàn)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件（北京雷安科技有限公司）。率及構(gòu)成比比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)預(yù)期頻率小于5時(shí)采用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.結(jié)果
　　3.1三組不同時(shí)間體重，血脂水平及肝腎功能
　　Cx37 siRNA組與非治療組(mock-siRNA亞組，生理鹽水亞組)豬的體重?zé)o差異，說明病毒轉(zhuǎn)染不影響豬的生長。同樣的，血清膽固醇和甘油

19、三脂水平也無差異，提示基因轉(zhuǎn)染的療效是獨(dú)立于血脂水平獨(dú)立存在的。另外，肝腎功能在組內(nèi)、組間均無差異，提示SiRNACx37病毒轉(zhuǎn)染對豬肝腎功能無明顯影響。
　　3.2體外基因沉默:用Western blot法檢測Cx37沉默效果最佳的位點(diǎn)。
　　HEK293細(xì)胞株通過慢病毒轉(zhuǎn)染---基于載體表達(dá)的三種不同Cx37 siRNA1、2、3，基因沉默分析顯示，siRNA Cx372、3片段是沉默效果最好的干擾片段。根據(jù)結(jié)果，我們選

20、擇siRNA Cx372，3片段進(jìn)行體外試驗(yàn)研究。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:結(jié)果表明siRNA372，3片段基因Cx37 mRNA水平的沉默效果分別是52％，50％，蛋白水平的抑制效果分別是83％，81％。據(jù)此，我們選擇siRNA Cx373片段進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)研究。
　　3.3豬腹主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)有效的慢病毒轉(zhuǎn)染
　　預(yù)實(shí)驗(yàn)局部病毒懸液注射腹主動脈粥樣硬化證實(shí)了轉(zhuǎn)染的有效性。用綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)水平是用于檢測慢病毒轉(zhuǎn)染有效

21、性。在腹主動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)染一周后檢測到GFP熒光，表明轉(zhuǎn)染了siRNA，兩周后熒光增強(qiáng)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即轉(zhuǎn)染兩月后，GFP熒光即使微弱但仍可見。這些結(jié)果提示腹主動脈粥樣硬化斑塊轉(zhuǎn)染攜帶siRNA慢病毒的有效性。病毒的局部轉(zhuǎn)染不改變體重（34.89+4.16kg Cx37siRNA轉(zhuǎn)染組vs.34.54+3.87kg mock-siRNA亞組vs.31.96±4.84kg生理鹽水亞組）。
　　3.4體內(nèi)基因沉默
　　用實(shí)時(shí)PC

22、R和Western-blot分析轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒后腹主動脈粥樣硬化Cx37表達(dá)的水平。為評價(jià)體內(nèi)慢病毒介導(dǎo)的基因沉默有效性，本實(shí)驗(yàn)檢測豬腹主動脈粥樣硬化的Cx37 mRNA和蛋白表達(dá)水平。 Cx37mRNA水平在Cx37siRNA組下降到34％，mock-siRNA組下降到61％，生理鹽水組下降到94％(P＜0.05)，其中Cx37 siRNA組顯著下降。Western blot分析顯示Cx37蛋白表達(dá)水平在Cx37 siRNA干擾

23、組較其他組低（0.21±0.07 vs.0.65±0.06 vs.0.54±0.07）。由此可見，斑塊內(nèi)應(yīng)用siRNA Cx37慢病毒懸液能有效沉默Cx37。
　　3.5 IVUS檢測Cx37 siRNA在動脈粥樣硬化斑塊中的作用
　　10月時(shí)（注射Cx37 siRNA后兩月）斑塊壞死核心占比率較8月時(shí)（注射Cx37 siRNA前）降低（5.26±2.11 vs.7.83±1.03％，P＜0.05）。mock-siRNA和生

24、理鹽水組斑塊的壞死率在8月與10月間無差異(P=0.074，P=0.061)。Cx37 siRNA組斑塊體積較8月時(shí)減小(21.03±6.24 vs.31.23±10.23，P＜0.01)。相反，mock-siRNA和生理鹽水組，斑塊體積較8月時(shí)增大(38.54±13.56 vs.32.12±11.21 mm3，37.36±14.21 vs.30.21±12.02 mm3，P=0.031,P=0.027)。
　　結(jié)論: