針對缺血再灌注損傷發(fā)展新的治療策略探索性實驗研究.pdf

1、缺血再灌注損傷是指組織細胞遭受一定時間的缺血缺氧后恢復血流，組織損傷程度迅速增劇的情況。再灌注后大量鈣內(nèi)流，并生成大量氧自由基，是該類組織細胞損傷的主要發(fā)病機制。臨床上多種疾病如中風、心肌梗死、不可逆性休克、急性臟器功能衰竭及器官移植等的發(fā)生、發(fā)展都與缺血再灌注有關。
　　第一部分新型雙功能試劑四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物用于心臟缺血再灌注損傷的探索性研究
　　目的：
　　建立心臟缺血再灌注模型，探索四氫-β-咔啉

2、-RGD類肽綴合物的自由基清除活性,抗血栓形成活性和較高的穩(wěn)定性。
　　方法：
　　使用培養(yǎng)基培養(yǎng)P12細胞，置入96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)過24小時粘附階段后，更換培養(yǎng)基并分別添加濃度為12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的化合物12a-c至各孔，分別添加濃度為2mM硝普納(SNP)溶液并置入溫箱2小時產(chǎn)生NO損傷，1mM H2O2并置入溫箱1小時誘發(fā)H2O2損傷，1mM H2O2和30uMFe(II)置于溫箱

3、1小時誘發(fā)?OH損傷，通過MTT比色測定來計算細胞存活數(shù)量，以此評估四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示，使用方差分析來對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，p<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。取材大鼠胸主動脈并迅速將其置于灌注液中，加入10-9mol/L去甲腎上腺素(NE)溶液,當高張性收縮達到最大水平時，清洗掉NE固定血管帶30分鐘。更換溶液，再次添加最終濃度為10-9mol/L的NE。當主動脈帶的高張性

4、收縮數(shù)值再次達到頂峰時，分別加入15μl生理鹽水或15?l濃度為10-6mol/L化合物12c的水溶液。固定后加入15μl最終濃度為10-6mol/L的乙酰膽堿溶液，記錄這種測試化合物對乙酰膽堿誘導血管舒張作用的抑制百分率作為結(jié)果，評估四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物對乙酰膽堿誘導血管舒張作用的抑制作用。對加入抗凝劑枸櫞酸鈉的正常兔血離心獲得的富含血小板的血漿進行血小板計數(shù)，添加自體血漿至2×105/μL濃度，使用PAF或ADP誘發(fā)血小

5、板凝集，分別加入四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物并對其結(jié)果進行量化分析，選擇血小板聚集曲線的頂峰高度為最大血小板聚集率(Am％)。評估四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物抗血小板聚集活性。大鼠麻醉后分離右頸總動脈和左側(cè)頸靜脈，將一個稱量好的6cm線置于一個聚乙烯管的中央，聚乙烯管充滿肝素鈉溶液，一端插入左側(cè)頸靜脈，從另一端將肝素鹽水或測試化合物鹽溶液進行注射后，將該端插入右側(cè)頸動脈。15分鐘后移開線并稱量，記錄濕血栓的重量，晾干此線持續(xù)2周

6、時間并在此記錄干血栓的重量。測定四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物抗血栓活性。將10mg各種測試化合物分別溶于1ml磷酸鹽緩沖液(pH8)中，加入0.5毫克胰蛋白酶。使反應混合物保持37℃，使用高效液相色譜法每小時檢測一次受試化合物濃度。流動相為含有0.1% CF3COOH的25% CH3OH水溶液。測定四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物12a-c體外對胰蛋白酶的穩(wěn)定性。建立心肌缺血再灌注模型，麻醉雄性 Wistar大鼠經(jīng)外科手術操作后于左

7、冠狀動脈處留置4-0絲線，假手術組經(jīng)外科手術操作后不留置絲線，在冠脈阻斷前15分鐘給予大鼠灌注載體（二甲亞砜-生理鹽水，1:103; v/v）或12c（10 mg/kg），冠狀動脈阻斷30分鐘后恢復灌注120分鐘，隨機分為以下4組：（1）假手術+載體組；（2）假手術+12c組；（3）I/R+載體組；（4）I/R+12c組。檢測缺血心肌組織中丙二醛（MDA）含量。實驗結(jié)束后，再次結(jié)扎絲線，通過導管向左心室腔內(nèi)注射1% Evans藍溶液來描

8、繪左心室高危缺血區(qū)域，取心臟橫切片置于1%氯化三苯基四唑（TTC）溶液中，心臟被分為非缺血區(qū)域（Evans藍染色）和缺血再灌注區(qū)域（Evans藍不染色），而后者又分為缺血但存活部分（TTC染色），和梗死區(qū)域（TTC不染色）。使用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進行 Scheffé’s檢驗，如果存在差異，使用t檢驗對成對數(shù)據(jù)進行分析，如果P<0.05則被認為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　所有測試化合物的自由基清除能力(EC50

9、)在如下范圍內(nèi)：對 NO為88-96?M，對H2O2為34-75?M，對?OH為86-95?M。四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物12a,12b和12c的EC50值與1a的結(jié)果非常相似，這說明它們具有與1a相似的NO，H2O2和-OH清除能力。對乙酰膽堿誘發(fā)血管舒張的抑制百分率來表示，前體化合物1a表現(xiàn)出良好的抑制能力，結(jié)果為81.03±4.12%；而四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物(12a-c)則表現(xiàn)出了更高的抑制能力，分別為90.12

10、±1.63,95.77±2.93,和97.15±1.15%。乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張作用被四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物1a和12a-c顯著抑制。對于ADP-誘發(fā)的血小板聚集，使用12a–c濃度為10-6 mol/L血小板聚集率降低至28–30%(NS:55.80%±4.32%;1a:47.83%±3.58%，n=8，p<0.001)。在PAF-誘發(fā)的血小板聚集實驗中，可觀察到類似的結(jié)果。四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物很有可能對血小板

11、聚集有非常強的抑制作用。使用12a-c治療的血栓重量分別為4.85±0.93 mg,3.79±0.29 mg,和2.23±0.16mg(NS:9.28±1.32，p<0.01)。所以，在使用劑量為5μmol/kg的時候，12a-c的抗血栓形成活性要高于11a-c。在胰蛋白酶進行水解作用后12a、12b和12c的耗竭時間分別為4小時、3小時和4小時。再灌注開始120分鐘后，MDA含量在假手術組和缺血再灌注及12c治療組中均較低，但是在缺血

12、再灌注無12c治療組中，MDA含量為4.90±0.87 nmol/mg組織，而12c可減少MDA含量至2.91±0.63 nmol/mg組織。12c能夠減輕脂質(zhì)過氧化反應和細胞損傷。完全阻斷心臟血流30分鐘后，發(fā)現(xiàn)整個心室均為高危區(qū)域，12c治療組較缺血再灌注損傷組心肌梗死面積的百分率明顯降低。
　　結(jié)論：
　　四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物具有抗血栓形成能力,自由基清除能力和較高的穩(wěn)定性，可能能夠減輕缺血再灌注造成的損傷

13、。
　　第二部分新穎的氮氧自由基-氨基酸綴合物用于肝臟缺血再灌注損傷的探索性研究
　　目的：
　　本研究試圖將抗氧化部分（氮氧自由基）與一系列氨基酸進行鏈接，以期合成氮氧自由基-氨基酸綴合物，探索其是否能夠?qū)Ω闻K缺血再灌注損傷提供協(xié)同保護作用。
　　方法：
　　使用培養(yǎng)基培養(yǎng)P12細胞，置入96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)過24小時粘附階段后，更換培養(yǎng)基并分別添加濃度為12.5?M,25?M,50?M,100?M,200

14、?M的測試化合物至各孔，分別添加濃度為2mM硝普納(SNP)溶液并置入溫箱2小時產(chǎn)生NO損傷，1mM H2O2并置入溫箱1小時誘發(fā)H2O2損傷，1mM H2O2和30uMFe(II)置于溫箱1小時誘發(fā)?OH損傷，通過MTT比色測定來計算細胞存活數(shù)量，以此評估氮氧自由基-氨基酸綴合物的自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示，使用方差分析來對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，p<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。肝臟缺血再灌注損傷模型，麻醉雄性

15、Wistar大鼠經(jīng)外科手術操作后用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，30min后去除血管夾，恢復缺血肝血流。雄性Wistar大鼠被隨機分為三組：（1）假手術組(n=4)；（2）缺血再灌注組：肝臟缺血30分鐘后恢復灌注2小時（n=8）；（3）缺血再灌注+藥物干預組：在恢復灌注前10分鐘及恢復灌注后1小時兩次給藥，均給予測試化合物(n=8)。（1）和(2）組的大鼠使用生理鹽水作為對照，進行腹腔內(nèi)注射。實驗結(jié)束后處死大鼠，立即取材血液

16、和肝臟標本，于?70℃下冷凍。分別測定血清ALT、AST水平，測定組織勻漿及血漿丙二醛（MDA）水平。將肝臟標本迅速冷凍，切片、并行HE染色。用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進行Scheffé’s檢驗，如果存在差異，使用t檢驗對成對數(shù)據(jù)進行分析。如果P<0.05則被認為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　氮氧自由基-氨基酸綴合物（NNR和NNK）針對不同自由基表現(xiàn)出與其親代化合物氮氧自由基（NN）相當?shù)淖杂苫宄芰Γ洳顒e無統(tǒng)

17、計學差異。在缺血再灌注組MDA水平(4.86±2.43nmol/mg)較假手術組MDA水平(1.75±0.26nmol/mg)顯著升高（P<0.05），L-精氨酸或NNR治療組均使得MDA水平較缺血再灌注損傷組下降。缺血再灌注組血清ALT水平為1530±750U/L，較假手術組（52±4 U/L）明顯升高，且具有顯著差異（P<0.001)。NNR+I/R組中ALT水平為173±50 U/L，明顯低于I/R組(P<0.05)，但高于假手術

18、組。缺血再灌注組血清AST水平為1894±875U/L，較假手術組（182±30U/L）明顯升高，且具有顯著差異（P<0.001)。NNR+I/R組中AST水平為510±138U/L，明顯低于I/R組(P<0.05)，但依然高于假手術組。雖然NNR治療組的ALT和AST水平均低于L-精氨酸治療組，但兩者之間均無顯著性差異。組織形態(tài)學結(jié)果說明雖然在 I/R+NNR治療組中可以看到充血、壞死和肝細胞變化，但是其較I/R組形態(tài)學有明顯的改善。

19、
　　結(jié)論：
　　氮氧自由基-氨基酸綴合物可以顯著減少肝臟缺血再灌注造成的損傷。
　　第三部分新型的氮氧自由基-甘氨酸綴合物用于腎臟缺血再灌注損傷的探索性研究
　　目的：
　　利用腎臟缺血再灌注損傷大鼠模型來評估這種新型氮氧自由基-氨基酸綴合物的生物學活性，探討氮氧自由基-氨基酸綴合物是否能夠?qū)δI臟缺血再灌注損傷起到保護作用。
　　方法：
　　使用培養(yǎng)基培養(yǎng)P12細胞，置入96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)過2

20、4小時粘附階段后，更換培養(yǎng)基并分別添加濃度為12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的測試化合物至各孔，分別添加濃度為2mM硝普納(SNP)溶液并置入溫箱2小時產(chǎn)生NO損傷，1mM H2O2并置入溫箱1小時誘發(fā)H2O2損傷，1mM H2O2和30uMFe(II)置于溫箱1小時誘發(fā)?OH損傷，通過MTT比色測定來計算細胞存活數(shù)量，以此評估氮氧自由基-甘氨酸綴合物自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示，使用方差分析來

21、對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，p<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。取材大鼠胸主動脈并迅速將其置于灌注液中，加入10-9mol/L去甲腎上腺素(NE)溶液，當高張性收縮達到最大水平時，清洗掉NE固定血管帶30分鐘。更換溶液，再次添加最終濃度為10-9mol/L的NE。當主動脈帶的高張性收縮數(shù)值再次達到頂峰時，分別加入15?l生理鹽水或15?l測試化合物的水溶液。固定后加入15?l最終濃度為10-6mol/L的乙酰膽堿溶液，記錄這種測試化合物對乙

22、酰膽堿誘導血管舒張作用的抑制百分率作為結(jié)果，評估氮氧自由基-甘氨酸綴合物對乙酰膽堿誘導血管舒張作用的抑制作用。建立腎臟缺血再灌注模型，麻醉雄性Wistar大鼠經(jīng)外科手術操作，使用動脈夾夾閉腎動脈60分鐘，開放恢復血供3小時。大鼠被隨機分為3組：（1）對照組：（n=4）；（2）缺血再灌注組：腎臟缺血60分鐘后恢復灌注3小時（n=6）；（3）缺血再灌注+藥物干預組：在恢復灌注前10分鐘及恢復灌注后1小時兩次給藥，分別通過腹腔內(nèi)注射的方式給予

23、測試化合物。（1）和（2）組的大鼠使用生理鹽水作為對照，進行腹腔內(nèi)注射。實驗結(jié)束后處死大鼠，立即取材血液和腎臟標本，于?70℃下冷凍。測定腎臟丙二醛（MDA）水平和谷胱甘肽（GSH）水平、腎臟MPO活性及血尿素氮的水平。將腎臟標本切片、并行HE染色。用兩因素方差分析后，原始數(shù)據(jù)進行Scheffé’s檢驗，如果存在差異，使用t檢驗對成對數(shù)據(jù)進行分析。如果P<0.05則被認為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　氮氧自由基-甘氨酸綴合

24、物(GNN)顯示出與氮氧自由基(NN)相當?shù)淖杂苫宄芰?。較NN而言，并無統(tǒng)計學差異。乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張作用被氮氧自由基-甘氨酸綴合物抑制，較 NN而言，無統(tǒng)計學差異。在缺血再灌注組MDA水平較對照組MDA水平顯著升高（P<0.05），測試化合物治療組使得MDA水平較缺血再灌注損傷組下降。缺血再灌注組GSH水平較對照組降低，測試化合物治療組水平與對照組無明顯差異。缺血再灌注組MPO活性較對照組明顯升高，測試化合物治療組使得MPO活

25、性較缺血再灌注損傷組下降。缺血再灌注組血尿素氮水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，測試化合物治療組使得MPO活性較缺血再灌注損傷組明顯下降。組織形態(tài)學結(jié)果說明缺血再灌注導致了腎小球內(nèi)和腎小管周圍的膠原增生，而缺血再灌注損傷+氮氧自由基-甘氨酸綴合物治療組的腎臟組織的損傷明顯減輕。
　　結(jié)論：
　　氮氧自由基-甘氨酸綴合物可顯著地降低組織脂質(zhì)過氧化反應的水平，明顯地保護腎臟功能和減少組織學改變。
　　第四部分新穎的T

26、EMPO-PEG-RGDs小肽綴合物用于急性下肢缺血性疾病探索性研究
　　目的：
　　通過觀察在 ADP-或 PAF-誘發(fā)的體外血小板聚集實驗和大鼠動脈血栓形成實驗中新型化合物 TEMPO-PRG-RGDs綴合物抗小板聚集和抗血栓活性的影響，及TEMPO-PEG-RGDs綴合物進行大鼠主動脈帶實驗中對缺血再灌注組織中自由基清除能力的研究，探討TEMPO-PEG-RGDF（作為一種代表化合物）減輕缺血再灌注造成的局部和遠程臟器

27、損傷的相關機制。
　　方法：
　　健康清潔級wister大鼠38只（雄性,月齡4月，體重250～300g）被隨機分為3組：（1）假手術組：大鼠經(jīng)受外科手術操作過程（如下所述），但未進行缺血再灌注損傷處理（n=6）；（2）缺血再灌注組：大鼠經(jīng)受下述外科手術操作，下肢缺血3小時后恢復灌注4小時（n=8）；（3）缺血再灌注損傷+藥物干預組：在缺血發(fā)生前15分鐘及缺血發(fā)生后15分鐘兩次給藥，均給予TEMPO-PEG-RGDF綴合物(

28、20 mg/kg)，在再灌注發(fā)生前15分鐘和再灌注發(fā)生1小時后均再次分別腹腔注射 TEMPO-PEG-RGDF綴合物(20 mg/kg)。（n=8）（1）和（2）組的大鼠使用生理鹽水進行腹腔內(nèi)注射作為對照。實驗結(jié)束時立即分離下肢肌肉及心肌組織，并自升主動脈快速取血，組織標本分為兩部分，其中一部分被用于進行脂質(zhì)過氧化分析，依據(jù)Beuge和Aust方法來測定MDA水平評估脂質(zhì)過氧化反應；另一部分立即在-30℃使用冰凍切片機制作組織切片、HE

29、染色、通過測量組織濕/干重量比值（W/D ratio）來評價組織水腫程度以進行組織形態(tài)學研究。使用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進行 Scheffé’s檢驗，如果存在差異，使用t檢驗對成對數(shù)據(jù)進行分析。所有的值用均數(shù)±標準差表示，如果P<0.05則被認為具有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　在ADP-誘發(fā)血小板聚集實驗及PAF-誘發(fā)血小板聚集實驗中，本研究TEMPO-PEG-RGDs綴合物表現(xiàn)出來抗血小板聚集的活性。尤其是在體外細

30、胞實驗中TEMPO-PEG-RGDs(最終濃度為100nM;溫箱培養(yǎng)時間為120分鐘)，與血小板上存在的ADP或 PAF共存時，會顯著改變血小板的聚集。本研究利用之前提到的大鼠模型進行體內(nèi)實驗評估了 TEMPO-RGDs and TEMPO-PEG-RGDs的抗血栓作用，血栓重量改變被作為評估指標(表3)。TEMPO-RGDs治療組(TEMPO-RGDS，TEMPO-RGDV，TEMPO-RGDF)的血栓重量分別為25.9±2.6,25

31、.1±1.9，and22.3±2.2 mg(NS:40.1±2.2 mg)。值得關注的是TEMPO-PEG-RGD(S，V,F)的抗血栓活性，濕血栓重量分別為23.6±2.8,24.7±2.2，and20.7±2.5 mg，較同等劑量(5μmol/kg)阿司匹林治療組(27.6±2.2 mg)要高。本研究中TEMPO它本身是一種弱的乙酰膽堿誘發(fā)血管舒張的抑制劑。相反，乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張能夠顯著地被TEMPO-RGDs或TEMPO-P

32、EG-RGDs綴合物所抑制，且這種抑制作用是劑量依賴性的。同時TEMPO-PEG-RGDs對于乙酰膽堿誘發(fā)血管舒張的抑制作用要強于 TEMPO-RGDs，但是兩者間并無顯著性統(tǒng)計學差異。假手術組(Sham),缺血再灌注組(I/R),缺血再灌注損傷+藥物干預組組織水腫評估顯示：Sham(3.18±0.25)，(I/R)組（5.60±0.37）(I/R+TEMPO-PEF-RGDF)（3.45±0.21），可見缺血再灌注組組織水腫情況較對照

33、組明顯加重(P<0.05)，但通過使用TEMPO-PEF-RGDF小肽綴合物后，較缺血再灌注組組織水腫情況明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)。本研究也通過進行丙二醛（MDA）過氧化物歧化酶（SOD）定量分析來評價氧化應激反應，假手術組(Sham),缺血再灌注組(I/R),缺血再灌注損傷+藥物干預組(I/R+TEMPO-PEG-RGDF) SOD和MDA水平檢測是：假手術組SOD（5.38?1.45）與MDA（2.19?0.38）；缺血再灌注組(I

34、/R) SOD（3.74?1.52）與MDA（5.65?0.29）；藥物干預組(I/R+TEMPO-PEG-RGDF) SOD（5.09?0.83）和MDA（2.37?0.44）?？梢奡OD和MDA的活性表達在假手術組與缺血再灌注組之間存在明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在缺血再灌注組與藥物干預組同樣存在明顯差異(P<0.05)。因此，本研究認為TEMPOL本身治療能夠逆轉(zhuǎn)MDA的升高水平至一個較低的程度。SOD抑制自由基和粘附分子的

35、表達，所以能夠?qū)∪馊毖俟嘧p傷產(chǎn)生保護作用。冰凍切片機制作組織切片、HE染色進行組織形態(tài)學研究示：假手術組大鼠骨骼肌橫切面切片顯示了正常的結(jié)構(gòu)（HE染色），可見典型的肌束外包的肌束膜，同等大小的肌纖維以鑲嵌模式排列。相反，缺血再灌注組切片可見肌肉水腫、中性粒細胞聚集和細胞死亡。改良三色染色可以顯示間質(zhì)水腫，肌原纖維溶解，細胞膜破裂，細胞水腫和壞死，及可見散發(fā)的破裂紅纖維，都說明出現(xiàn)廣泛的細胞損傷。另外，I/R組大鼠骨骼肌組織切片的N

36、ADH(煙酰胺-腺嘌呤-二核苷酸)染色可發(fā)現(xiàn)氧化代謝酶的無序分布。特別是在 NADH染色中慢肌纖維染色較深，相反快肌纖維染色較淺因為糖酵解能力強且線粒體含量較低，TEMPO-PEG-RGDF干預還是緩解了大部分損傷。除了H/E染色中偶見的空泡化纖維外，大多數(shù)肌肉纖維擁有完整的清楚邊界，內(nèi)容物質(zhì)地均勻，形態(tài)均勻一致。同時絕大多數(shù)纖維中NADH反應較弱，反應了TEMPO-PEG-RGDF對于缺血再灌注損傷的治療作用確實保護了大多數(shù)的組織。<

37、br>　　結(jié)論：
　　本項研究使用新型化合物 TEMPO-PRG-RGDs綴合物進行 ADP-或PAF-誘發(fā)的體外血小板聚集實驗和大鼠動脈血栓形成實驗，實驗結(jié)果顯示TEMPO-PEG-RGDs綴合物具有顯著的抗血小板聚集和抗血栓活性。同時，使用TEMPO-PEG-RGDs綴合物進行大鼠主動脈帶實驗來評估其自由基清除能力。TEMPO-PEG-RGDF（作為一種代表化合物）同樣顯示了其具有減輕脂質(zhì)過氧化反應，減輕缺血再灌注造成的局部和

38、遠程臟器損傷的潛力。本項研究推測 TEMPO-PEG-RGDs可能刺激單核細胞，且其氮氧自由基能夠清除細胞內(nèi)超氧離子和羥基自由基，從而抑制組織因子的合成而起到抗血栓形成的作用。PEG化學修飾可延長TEMPO-PEG-RGDs綴合物的半衰期及在血液循環(huán)中的持續(xù)時間，從而提高治療作用。我們預言，新穎的TEMPO-PEG-RGDs綴合物有可能發(fā)展成為治療缺血再灌注損傷的有效藥物。
　　第五部分新奇的小肽綴合物用于急性下肢缺血探索性研究<

39、br>　　目的:
　　通過將β-咔啉生物堿多肽與溶栓多肽進行鏈接，以探求β-咔啉生物堿-小肽綴合物的抗氧化和溶栓雙重活性；同時建立下肢缺血再灌注損傷模型，探索小肽綴合物對缺血肢體的保護性作用及機制，從而為臨床治療骨骼肌缺血再灌注腎損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　健康清潔級雄性Wistar大鼠(250-300 g;食水不限)被隨機分為3組：（1）假手術組（n=6）：大鼠經(jīng)受外科手術操作過程，但未進行缺血再灌注損傷處理

40、；（2）缺血再灌注組（n=8）：大鼠經(jīng)受下述外科手術操作，下肢缺血3小時后恢復灌注4小時；（3）缺血再灌注損傷+藥物干預組（n=8）：在恢復灌注前15分鐘及恢復灌注后1小時兩次給藥，均給予β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)（20mg/Kg）。（1）和（2）組的大鼠使用生理鹽水作為對照，進行腹腔內(nèi)注射。實驗結(jié)束后處理大鼠，立即分離下肢肌肉及心肌組織，并自升主動脈快速取血，組織標本分為兩部分，其中一部分使用硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物生物化學分析

41、法檢測細胞膜脂質(zhì)過氧化指標血漿丙二醛（Malondialdehyde，MDA）活性，以定量評價缺血危險區(qū)脂質(zhì)過氧化程度，另一部分立即在-30℃使用冰凍切片機制作組織切片進行組織形態(tài)學研究。利用細胞活體使用PC12細胞測試β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a,b,c)及其前體2a,b,c在對抗NO,H2O2和?OH時的自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示。通過大鼠活體研究評估β-咔啉生物堿-小肽綴合物(24a,b,c,25a,b,

42、c,26a,b,c)是否具有母體化合物類似的溶栓活性。最終使用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進行 Scheffé’s檢驗，如果存在差異，使用t檢驗對成對數(shù)據(jù)進行分析。所有的值用均數(shù)±標準差表示，如果P<0.05則被認為具有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　β-咔啉生物堿-小肽綴合物溶栓活性評估結(jié)果顯示：所有檢測物的清除能力（EC50）分別為：對NO為77-110?M，對H2O2為38-66?M，對?OH為72-94?M。β-咔啉生

43、物堿-小肽綴合物在體外胰蛋白酶作用下的穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示：β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a，26b和26c)在體外胰蛋白酶作用下衰竭時間分別為4小時，3小時和3小時。β-咔啉生物堿-小肽綴合物對于脂質(zhì)過氧化反應標記物-丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平影響顯示：肌肉缺血再灌注損傷組 I/R的缺血骨骼肌 MDA含量（7.8?0.3）較對照組Sham（0.6?0.1）明顯升高(P<0.05)，同時使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26

44、a)進行干預后即I/R+26a組MDA（2.8?0.2）水平明顯回落(P<0.05)。肌肉缺血再灌注損傷組I/R的缺血骨骼肌GSH含量（0.2?0.05）較對照組 Sham（1.3?0.2）明顯降低(P<0.05)，同時使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進行干預后即I/R+26a組GSH（1.0?0.1）水平明顯升高(P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷組 I/R的缺血骨骼肌 MDA含量（5.1?0.4）較對照組Sham（1.3?0

45、.1）明顯升高(P<0.05)，同時使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進行干預后即 I/R+26a組 MDA（1.5?0.1）水平明顯回落(P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷組 I/R的缺血骨骼肌GSH含量（4.9?1.7）較對照組Sham（16.8?2.1）明顯降低(P<0.05)，同時使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進行干預后即I/R+26a組GSH（14.7±3.2）水平明顯升高(P<0.05)。血液中缺血再灌注損傷

46、組 I/R的缺血骨骼肌MDA含量（5.8±0.3）較對照組Sham（2.5?0.1）明顯升高(P<0.05)，同時使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進行干預后即 I/R+26a組MDA（2.8±0.2）水平明顯回落(P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷組I/R的缺血骨骼肌GSH含量（4.1±0.3）較對照組Sham（4.1±0.3）明顯降低(P<0.05)，同時使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進行干預后即I/R+26a組GS

47、H（9.1±0.2）水平明顯升高(P<0.05)。組織形態(tài)學研究：對骨骼肌冰凍橫截面切片行HE染色進行常規(guī)組織學分析，假手術組大鼠切片結(jié)果顯示肌纖維具有均勻的大小和形狀，成鑲嵌分布，多數(shù)彼此之間直接接觸，期間僅有一層薄薄的肌內(nèi)膜，總體來說，是正常的組織學表現(xiàn)。相反，缺血3小時后再灌注導致重度的間質(zhì)水腫，及以腫脹和炎癥細胞浸潤為特征的損傷。另一方面，使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進行干預后可預防間質(zhì)水腫，微血管的橫截面區(qū)域基本上

48、沒有改變。使用H/E染色的假手術組大鼠心肌切片顯示正常的結(jié)構(gòu)和緊密的心肌排列。缺血再灌注損傷組中再灌注引起的心肌損傷是明顯的，體現(xiàn)在血管周圍區(qū)域和肌纖維之間的組織水腫。水腫廣泛存在于心肌纖維和血管周圍。缺血再灌注+β-咔啉生物堿-小肽綴合物治療組中壞死并不明顯，且在間質(zhì)區(qū)和小血管內(nèi)僅可觀察到非常少量的炎癥細胞。
　　結(jié)論:
　　本項研究使用藥物干預缺血再灌注損傷以期獲得治療效果，一系列新合成的β-咔啉生物堿-小肽綴合物，在動

49、物模型和細胞實驗中，均表現(xiàn)出溶栓活性和自由基清除能力。本項研究選擇其中一種β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)在下肢缺血再灌注損傷模型中進一步實驗，發(fā)現(xiàn)其具有有效的自由基清除能力和溶栓活性,能夠?qū)勾笫笾w缺血再灌注引發(fā)的局部和遠隔器官的損傷，而起到保護作用。本項研究結(jié)果顯示β-咔啉生物堿-小肽綴合物可能成為一種新的抗缺血再灌注損傷的治療方法。
　　第六部分氮氧自由基綴合物聯(lián)合缺血后處理對下肢缺血再灌注損傷治療作用的實驗研究

50、>　　目的：
　　本項研究通過對缺血組織后處理并聯(lián)合靜脈注射氮氧自由基綴合物的方式來共同應對缺血再灌注損傷，評估甘氨酸-氮氧自由基綴合物聯(lián)合缺血后處理在急性下肢缺血再灌注損傷大鼠模型中的相關治療作用。
　　方法：
　　健康清潔級wister大鼠38只（雄性,月齡4月，體重250～3000g）隨機分五組：假手術組（n=6）：僅進行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流7h處理動物；缺血再灌注組（n=8）：止血帶完全阻斷后肢血流3h，松

51、解阻斷4h后處理動物；缺血再灌注+GNN治療組（n=8）:止血帶完全阻斷后肢血流3h，按30mg/kg劑量經(jīng)口喂食GNN藥丸，于恢復灌注前15分鐘以10mg/kg/min靜脈注射GNN，松解阻斷4h后處理動物；缺血后處理合并靜脈注射生理鹽水組（n=8）:止血帶完全阻斷后肢血流3h，松解阻斷后，以60秒間隔反復阻斷后恢復灌注四個循環(huán)，以上述劑量于恢復灌注前15分鐘靜脈注射生理鹽水，4h后處理動物；缺血后處理合并靜脈注射GNN組（n=8）:

52、止血帶完全阻斷后肢血流3h，松解阻斷后，以60秒間隔反復阻斷后恢復灌注四個循環(huán)，以上述劑量于恢復灌注前15分鐘靜脈注射GNN，4h后處理動物。按各組要求時間點立即于升主主動抽取血液標本5ml，離心后取血清，裝入無菌凍存管，－70℃凍存?zhèn)溆?。并迅速取材各組織臟器，分為兩份，其中一份部分組織稱重以生理鹽水制備成10%勻漿，離心后取上清液裝入干凈凍存管，液氮凍存，進行濕重/干重（W/D）比例的測定、組織勻漿及血漿丙二醛（Malondialde

53、hyde，MDA）測定、組織勻漿髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性測定、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），血尿素氮（BUN）及血肌酐（Cr）含量測定及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平測定；另一部分組織用于干/濕比的測定。另一份冰凍切片機于-30℃溫度下行組織切片，采用HE染色，觀察組織形態(tài)的改變。最終數(shù)據(jù)使用雙因子方差分析后加用Scheffé’s檢驗來對組間差異進行比較，如果存在差異，使用

54、t檢驗來比較成對數(shù)據(jù)。結(jié)果表達為均數(shù)±標準差。如果P<0.05則被認為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　血漿及肺組織勻漿MDA水平：缺血再灌注損傷組血漿（3.45±0.44nmol/ml）及肺組織（84.5±3.7nmol/g tissue）中MDA水平均較假手術組（血漿:1.67±0.13nmol/ml）；肺組織：41.8±3.2nmol/g tissue））明顯升高。但是單純?nèi)毖筇幚斫M大鼠MDA水平較缺血再灌注損傷組大鼠

55、無明顯下降。單純GNN治療（血漿:2.28±0.38nmol/ml）；肺組織：60.3±3.5nmol/g tissue））與GNN聯(lián)合缺血后處理治療（血漿:1.89±0.20nmol/ml）；肺組織：52.7±4.9nmol/g tissue））均可明顯抑制MDA產(chǎn)生，這說明其可減弱脂質(zhì)過氧化反應及細胞損傷。組織氧化應激損傷的指標——髓過氧化物酶（MPO）活性結(jié)果：缺血再灌注組大鼠 MPO水平（19.3±1.9 U/g）較假手術組大鼠

56、（8.0±0.6 U/g）顯著升高。單純GNN治療組大鼠（10.4±1.2 U/g）及GNN合并缺血后處理治療組大鼠（9.3±1.3 U/g）較缺血再灌注損傷大鼠的肺 MPO活性明顯降低。血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）結(jié)果：缺血再灌注損傷組大鼠（130.6±5.7 pg/ml）較假手術組大鼠（51.2±6.9 pg/ml）的TNF-α水平顯著升高。單純GNN治療組（85.8±9.1 pg/ml）及GNN合并缺血后處理治療組（72.2±

57、9.5 pg/ml）均較缺血再灌注損傷組的炎性細胞因子水平均顯著下降，GNN合并缺血后處理叫單純GNN治療更加有效，但是這些組間并無統(tǒng)計學差異。組織水腫的程度可通過測量組織濕干比（W/D）來進行評價，結(jié)果所示再灌注損傷后組織水腫明顯。缺血再灌注損傷組大鼠較假手術組大鼠血清AST及ALT水平均明顯升高，說明導致了嚴重的肝細胞損傷。單純GNN治療組大鼠及GNN合并缺血后處理進行干預均可有效降低ALT及AST的水平。缺血再灌注組較假手術組血B

58、UN水平明顯升高，單獨給予GNN干預及GNN合并缺血后處理治療均可顯著降低血BUN水平。而且急性下肢缺血再灌注損傷確實導致血Cr濃度升高，而單獨給予GNN干預及GNN合并缺血后處理治療同樣可顯著降低Cr水平。
　　結(jié)論：
　　在該項研究中我們發(fā)現(xiàn)，單純進行缺血后處理（間隔為60秒的四組循環(huán)）干預并未能起到顯著的保護作用。但是當缺血后處理與氮氧自由基綴合物GNN共同作用時，兩者共同作用的治療效果就相當顯著了。這向我們提示缺血后