維甲酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞分化過(guò)程中核基質(zhì)蛋白的變化研究.pdf

1、本論文以維甲酸( retinoic acid，RA)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞，鑒定RA對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的終末分化誘導(dǎo)效果。在此基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析、免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等技術(shù)，對(duì)在SK-N-SH細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中核基質(zhì)蛋白的變化進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。分析鑒定和確證了與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖分化相關(guān)的特異核基質(zhì)蛋白，并研究特異核基質(zhì)蛋白與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞相關(guān)癌基因、抑癌基因在細(xì)胞內(nèi)的共定位關(guān)系與變化

2、，探索它們?cè)谏窠?jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的調(diào)控作用，以期能夠在較為整體水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞癌變與逆轉(zhuǎn)機(jī)理問(wèn)題，從而找出神經(jīng)細(xì)胞增殖與分化相關(guān)的靶向性蛋白。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)1μmol/L RA處理之后，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)57.93％，細(xì)胞發(fā)生了Go/Gi期阻滯。光鏡和電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)1μmol/L RA處理后的SK-N-SH細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生恢復(fù)性變化，細(xì)胞呈極

3、性狀、伸出多個(gè)軸突樹(shù)突狀突起、細(xì)胞逐漸變小變圓并融合在一起形成類似神經(jīng)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)核質(zhì)比例減小，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞表面微絨毛減少，細(xì)胞核形態(tài)趨于規(guī)則、核仁數(shù)目減少，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)減少、常染色質(zhì)增多，細(xì)胞內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多、高爾基體結(jié)構(gòu)更為典型等變化；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)RA誘導(dǎo)處理后，SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)癌基因c-myc、c-fos表達(dá)產(chǎn)物減少，抑癌基因p53、p27表達(dá)產(chǎn)物增多；同時(shí)，RA能夠促進(jìn)SK-N-SH細(xì)胞

4、的神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE、Synaptophysin、MAP2的表達(dá)。選擇性抽提整裝光鏡和電鏡觀察顯示，經(jīng)RA處理的SK-N-SH細(xì)胞核基質(zhì)纖維和中間纖維數(shù)量和層次更加豐富，分布更為均勻，單絲成份增多，與核纖層聯(lián)系更為緊密，形成貫穿整個(gè)核質(zhì)區(qū)域的較為規(guī)則的纖維網(wǎng)絡(luò)。雙向凝膠電泳與MALDI-TOF質(zhì)譜分析共鑒定出41個(gè)在RA誘導(dǎo)分化前后表達(dá)差異的核基質(zhì)蛋白，其中在分化的SK-N-SH細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)為：Vimentin、MTMR

5、2、SUMO-3等；表達(dá)下調(diào)的蛋白為TRPV2、Nucleophosmin、Prohibitin等；處理后消失的蛋白為ATP synthase beta chain、PSB3;處理后新出現(xiàn)的蛋白為L(zhǎng)GII、SYCEI。蛋白質(zhì)印跡雜交與免疫熒光顯微鏡觀察確證了Nucleophosmin(NPM)、Prohibitin(PHB)、Vimentin和hnRNP A2/BI在SK-N-SH細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化及其在核基質(zhì)上的定位。激光共聚焦

6、顯微鏡觀察顯示NPM、PHB和hnRNP A2/B1與癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)均存在一定的共定位關(guān)系，并且它們的表達(dá)水平和細(xì)胞定位在誘導(dǎo)分化前后均發(fā)生了改變。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果還顯示NSE、SYP和MAP2與癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)也存在一定的共定位關(guān)系，它們的表達(dá)水平和細(xì)胞定位在誘導(dǎo)分化前后也發(fā)生了變化。 研究結(jié)果表明，1μmol/L R

7、A能有效抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞的增殖活動(dòng)，改變SK-N-SH細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征，下調(diào)癌基因c-myc、c-fos和上調(diào)抑癌基因p53、p27等的表達(dá)，從而對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化具有顯著誘導(dǎo)效果。在SK-N-SH細(xì)胞分化過(guò)程中，其核基質(zhì).中間纖維系統(tǒng)構(gòu)型產(chǎn)生了與正常細(xì)胞相似的恢復(fù)性變化，并且出現(xiàn)了多種差異表達(dá)的核基質(zhì)蛋白，其中NPM、PHB、Vimentin和hnRNP A2/B1為不同誘導(dǎo)分化物誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化

8、后出現(xiàn)的共同差異核基質(zhì)蛋白。而功能性共同差異核基質(zhì)蛋白NPM、PHB、hnRNP A2/B1和神經(jīng)元特異表達(dá)標(biāo)志物NSE、SYP、MAP2與c-Myc、c-Fos、P53、Rb等均存在共定位關(guān)系并在SK-N-SH細(xì)胞分化過(guò)程中出現(xiàn)分布和位移變化的現(xiàn)象。由此證實(shí)了RA能夠干預(yù)SK-N-SH細(xì)胞相關(guān)癌基因、抑癌基因的活性，改變一些與基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的重要核基質(zhì)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期，促使人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化。這為我們?cè)?/p>