CA125升高患者的良惡性鑒別方法研究.pdf

1、癌抗原125(cancer antigen125，CA125)是婦科最常用的血清腫瘤標(biāo)志物。約80％的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高。血清CA125水平能夠很好的反應(yīng)機(jī)體腫瘤負(fù)荷，因此是卵巢癌治療后的主要監(jiān)測(cè)隨訪指標(biāo)。但除了卵巢癌，血清CA125水平在許多其他良惡性疾病中也會(huì)異常升高。約1％的健康女性、6％的婦科良性疾病患者會(huì)出現(xiàn)血清CA125水平的升高。有研究者對(duì)一綜合醫(yī)療中心的血清CA125水平大于65U/ml的患者進(jìn)行分析

2、，發(fā)現(xiàn)74.3％的患者是婦科惡性腫瘤患者，10.2％為非婦科惡性腫瘤患者，另外13.1％為良性疾病患者，因此，CA125升高意義不明經(jīng)常導(dǎo)致患者的診療方案制定困難，并且給良性疾病患者帶來不必要的精神負(fù)擔(dān)。如果能找出良性來源和惡性來源CA125分子結(jié)構(gòu)之間的差異將能夠?qū)A125分子進(jìn)行分型，從而提高其診斷準(zhǔn)確性。
　　 目前對(duì)CA125分子結(jié)構(gòu)的了解已經(jīng)比較清晰。CA125是一種高度糖基化的粘蛋白。糖鏈部分約占整個(gè)分子質(zhì)量的20

3、％-70％。CA125分子經(jīng)酶切從細(xì)胞膜表面脫落進(jìn)入體腔或入血，成為游離CA125。CA125在成人組織中分布包括，苗勒氏管上皮，即輸卵管內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宮頸內(nèi)膜；腹膜、胸膜以及心包膜等間皮組織；支氣管上皮，支氣管粘膜下腺；以及角膜和結(jié)膜上皮。正常情況下，血清CA125由這些組織合成脫落入血而形成，并處于低水平。在卵巢癌患者中，癌組織能夠表達(dá)高水平的CA125，并且組織表達(dá)水平與血清水平呈正相關(guān)。因此，我們

4、推測(cè)卵巢癌患者血清中的CA125主要來源于癌組織。而在良性疾病情況下，CA125主要由腹膜、胸膜等間皮組織以及女性生殖器官粘膜等非惡性組織合成。因此，良惡性疾病中CA125具有不同性質(zhì)的來源。
　　 大量研究證明，惡性腫瘤常伴隨著糖鏈合成、降解以及連接相關(guān)分子的異常改變，從而導(dǎo)致蛋白的異常糖基化狀態(tài)。例如，肝癌中AFP的核心巖藻糖修飾增加，因此檢測(cè)核心巖藻糖修飾的AFP所占的比例能夠區(qū)分肝癌和慢性肝硬化，提高肝癌的早期診斷率。目

5、前在卵巢癌中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種糖基化修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)異常，如漿液性卵巢癌中唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal-Ⅲ、ST3Gal-Ⅳ和ST3Gal-Ⅵ表達(dá)下調(diào)，而ST3Gal-Ⅰ和ST6Gal-Ⅰ表達(dá)上調(diào)；黏液性卵巢癌中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶GnT-Ⅴ表達(dá)上調(diào)。另外，卵巢癌組織中多種糖蛋白的糖基化狀態(tài)改變也被證實(shí)。
　　 因此，我們推測(cè)惡性來源的CA125與其他良性疾病或生理狀況下的CA125存在不同的糖基化狀態(tài)，并且這一糖基化差異能夠被用于C

6、A125的進(jìn)一步分類，從而鑒別良惡性CA125升高患者。
　　 雖然人們很早就認(rèn)識(shí)到糖鏈結(jié)構(gòu)生物學(xué)意義的重要性，但由于糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和檢測(cè)技術(shù)的限制，使得對(duì)其含義的解讀一直滯后于基因和蛋白質(zhì)。目前對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)的分析主要基于質(zhì)譜技術(shù)和以凝集素為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。兩種方法各有利弊。質(zhì)譜技術(shù)是基于分子碎裂片段的質(zhì)荷比對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)。它能夠得到蛋白質(zhì)的氨基酸序列、糖鏈組成以及糖基化位點(diǎn)等信息。但質(zhì)譜分析不適合于分析含量低，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的

7、分子。另外質(zhì)譜分析對(duì)儀器、分析人員水平有很高的要求，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室很難達(dá)到。凝集素分析技術(shù)是利用凝集素與特異糖鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)合以達(dá)到糖鏈結(jié)構(gòu)及其含量推測(cè)的目的。由于凝集素與糖抗原的結(jié)合類似于抗原抗體反應(yīng)，因此它所識(shí)別的糖鏈結(jié)構(gòu)大多位于分子表面。這些結(jié)構(gòu)也恰好是糖鏈參與免疫識(shí)別等生物識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)，所以對(duì)生物功能分析更有意義。凝集素對(duì)于糖鏈的空間構(gòu)型、連接方式都有一定專一性，因此所得糖鏈空間結(jié)構(gòu)信息更精細(xì)。但凝集素技術(shù)所得到的信息只是此種糖抗原的

8、含量，而無法得到其定位等信息，因此在修飾位點(diǎn)分析方面弱于質(zhì)譜分析。除此之外，凝集素相關(guān)技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)難度較低，易于在普通實(shí)驗(yàn)室開展。
　　 本研究擬建立適于CA125糖基化狀態(tài)檢測(cè)的抗體.凝集素ELISA法，對(duì)血清CA125水平升高的婦科良惡性疾病患者CA125糖基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，尋找惡性腫瘤特異性CA125糖鏈結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)其用于鑒別良惡性CA125升高的能力。
　　 第一部分旨在建立適于CA125糖基化狀態(tài)檢測(cè)的抗體-凝

9、集素ELISA法?？贵w一凝集素ELISA法是通過包被抗體捕獲樣品中的抗原，繼而利用凝集素對(duì)抗原表面糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。由于抗體本身有糖基化修飾，因此我們首先利用高碘酸鈉對(duì)抗體糖鏈進(jìn)行氧化，繼而對(duì)其衍生化，達(dá)到封閉抗體糖鏈的目的。封閉后抗體上的大部分凝集素識(shí)別糖鏈信號(hào)被清除，使檢測(cè)背景信號(hào)明顯降低。為證明凝集素是通過識(shí)別CA125表面糖鏈產(chǎn)生的顯色信號(hào)，我們首先通過單糖抑制試驗(yàn)證明顯色信號(hào)是由凝集素對(duì)糖鏈的識(shí)別產(chǎn)生的，之后我們通過梯度摻入C

10、A125證明顯色信號(hào)強(qiáng)度與CA125含量是呈正相關(guān)的。最終確定5種凝集素：BPL、PNA、SBA、UEA、VVA能夠用于建立抗體-凝集素ELISA法。
　　 第二部分旨在使用已建立的抗體-凝集素ELISA法檢測(cè)血清CA125升高的婦科良惡性疾病患者其CA125糖基化狀態(tài)，尋找惡性腫瘤特異性CA125糖鏈結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)其用于鑒別良惡性CA125升高的能力。使用第一部分篩選出的五種抗體-凝集素ELISA法檢測(cè)血清CA125糖基化水平，結(jié)

11、果五種凝集素所識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)在惡性腫瘤來源的CA125中都呈高表達(dá)，其中VVA所識(shí)別的Tn抗原在兩組間差異最明顯。因此，我們構(gòu)建了以CA125抗體X325為包被抗體，識(shí)別Tn抗原VVA為檢測(cè)凝集素的抗體.凝集素ELISA法(簡(jiǎn)稱為CA125/Tn ELISA)，用于鑒別良惡性CA125升高患者。首先，我們使用對(duì)91例血清CA125水平大于35U/ml的患者進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，CA125/Tn ELISA用于診斷惡性腫瘤來源CA125的AU