青霉素G?；窪NA家族混組提高合成-水解比的研究.pdf

1、本文通過(guò)PCR將HisTag與PGA融合，在具有T7啟動(dòng)子的pET-24a(+)質(zhì)粒載體中進(jìn)行表達(dá)，建立了一個(gè)通用的PGA表達(dá)和純化方法，發(fā)酵獲得的粗酶經(jīng)Co2+-IDA瓊脂載體一步純化。四種重組野生型PGA(AfPGA、EcPGA、KcPGA、PrPGA)一步純化收率分別為27.6％、36.3％、33.6％、19.7％；純化倍數(shù)分別為40、183、107、17。對(duì)得到的四種重組PGA測(cè)定其參與7-ADCA和D-苯甘酰胺合成頭孢氨芐反應(yīng)

2、的S/H，分別為2.5、13、17、3.3?！　〔捎孟∮忻柑幚砦宸N青霉素G酰化酶基因(A.faecalis、B.megaterium、E.coli、K.citrophila、P.rettgeriPGAs)進(jìn)行DNA家族混組得到嵌合體基因α亞基嵌合子庫(kù)。在KcPGA基因的1054位(在α亞基和連接肽后)進(jìn)行沉默突變引入一KpnI位點(diǎn)，構(gòu)建含有該突變基因的質(zhì)粒(骨架載體)，從而容納嵌合體基因α亞基。PCR獲得的嵌合體片斷和骨架載體經(jīng)Nde

3、I/KpnI酶切后連接轉(zhuǎn)化，約5000個(gè)轉(zhuǎn)化子通過(guò)抑菌圈法(25mmol/L7-ADCA，50mmol/LD-PGA)初篩得到抑菌圈較大的嵌合體克隆，共篩得約400個(gè)克隆?！　『Y得的突變菌體經(jīng)試管發(fā)酵，用HPLC分析，挑選合成與水解產(chǎn)物峰面積比對(duì)照(KcPGA)高2倍以上的克隆進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?！　”狙芯拷⒘艘环N通用的克隆、表達(dá)和純化各種PGA的方法，使平行比較各種PGA的性質(zhì)以及通過(guò)定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化(亞基重組、DNA家族混組、基