鄰苯二甲酸酯類化合物好氧生物降解的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為六部分：
　　 第一部分：源水及飲用水中PAEs的定性分析
　　 目的：對(duì)長江、漢江（武漢段）水源水、飲用水中PAEs的污染狀況和深度水處理工藝（臭氧－活性炭）處理后出水中的PAEs化合物進(jìn)行定性分析。
　　 方法：以武漢自來水廠（宗關(guān)水廠、平湖門水廠）的源水、出廠水和管網(wǎng)末梢水為調(diào)查對(duì)象，分別于2007年、2008年平水期（3月）、豐水期（7月）、枯水期（12月）采集水樣，采樣量為100～120 L。

2、用 XAD-2 樹脂吸附水中的有機(jī)物，用二氯甲烷和丙酮進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后（相對(duì)于水中的含量，其濃縮比例為1：5000），通過GC/MS對(duì)有機(jī)物的成份進(jìn)行定性分析。2006年4月在南方某自來水廠的中試基地，將臭氧氧化，活性炭（生物活性炭）吸附工藝與傳統(tǒng)水處理工藝（混凝沉淀、加氯消毒）相結(jié)合，通過不同的工藝組合對(duì)當(dāng)?shù)卦此M(jìn)行處理。源水和不同組合工藝處理后出水的采集、有機(jī)物的濃縮和檢測(cè)與上面描述的方法相同。
　　 結(jié)論：源水和飲

3、用中的PAEs污染非常普遍，現(xiàn)有的自來水處理技術(shù)（常規(guī)水處理技術(shù)和深度水處理技術(shù)）難以將其徹底去除。
　　 第二部分：高效PAEs降解菌的馴化、篩選及鑒定
　　 目的：馴化活性污泥，從馴化污泥中分離出高效PAEs降解菌，并對(duì)其生物種屬進(jìn)行鑒定。
　　 方法：從武漢某印染廠取得活性污泥置于曝氣池中，以DMP、DEP和DBP為唯一碳源，采用活性污泥曝氣與密度梯度馴化方法，即從第1 周開始，等量投加DMP、DEP、DB

4、P作為細(xì)菌利用碳源。每周PAEs的投加濃度按10 mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、140 mg/L 依次遞增，連續(xù)馴化8 周。用滅菌采樣瓶從曝氣池采取污泥樣本，用接種環(huán)蘸取污泥，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線以分離純化細(xì)菌。在250 ml的錐形瓶中加入100 ml無機(jī)鹽培養(yǎng)液，高壓滅菌，加入等量DMP、DEP和DBP（各200 mg），按等生物量的原則加入分離出的細(xì)

5、菌，置于37 ℃空氣浴搖床中（140 rpm）連續(xù)降解7天。用二氯甲烷液液萃取各降解液，用GC法檢測(cè)其濃度。比較各細(xì)菌7天降解率的大小，篩選出高效降解細(xì)菌。對(duì)篩選出的高效PAEs降解菌，進(jìn)行革蘭染色。
　　 結(jié)合染色結(jié)果，用全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)其進(jìn)行生化鑒定。用電子顯微鏡拍攝高效降解菌的透射電鏡照片，觀察細(xì)菌形態(tài)學(xué)。提取細(xì)菌DNA，擴(kuò)增16S rDNA序列，并進(jìn)行堿基序列測(cè)定。將序列提交Genbank并進(jìn)行Blast 序列比對(duì)，

6、通過比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步鑒定該菌種屬。將細(xì)菌置于不同的溫度和不同的滲透壓下（不同的NaCl 濃度）培養(yǎng)，以考察該高效降解菌的生長特性。
　　 結(jié)論：采用活性污泥曝氣與密度梯度馴化方法，篩選出可高效降解PAEs的赤紅球菌（Rhodococcus ruber）。該細(xì)菌生長溫度范圍廣，能耐受較高的環(huán)境滲透壓。
　　 第三部分：赤紅球菌L4降解PAEs的特性研究
　　 目的：確定赤紅球菌L4降解PAEs的適宜條件（pH 值、溫

7、度和初始底物濃度），探索降解動(dòng)力學(xué)，對(duì)赤紅球菌L4降解相關(guān)特性進(jìn)行初步研究。
　　 方法：通過正交設(shè)計(jì)（三因素、四水平表）探索赤紅球菌L4降解PAEs的最佳溫度、pH及初始PAEs 濃度。以人工配制的不同初始濃度的PAEs 實(shí)驗(yàn)水樣為降解對(duì)象，每天取樣檢測(cè)殘留量，以曲線擬合方法獲得降解動(dòng)力學(xué)方程。為確定PAEs 在水中不同的存在狀態(tài)對(duì)降解效果的影響，分別用直接投加和丙酮（超聲）乳化的方法來配制PAEs 實(shí)驗(yàn)水樣(300 mg/L

8、)。為研究赤紅球菌L4的環(huán)境抵抗特性，將其接種于不同濃度的乙醇、二甲基乙酰胺、正辛烷和甲苯溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)以調(diào)查其存活率。將赤紅球菌L4分別接種于4 mmol/L的苯甲酸鈉、苯酚、萘、對(duì)硝基酚、鄰硝基酚和葡萄糖溶液中，以O(shè)D600 值作為觀測(cè)指標(biāo)，考察該細(xì)菌對(duì)有機(jī)物的利用譜。用油膜法測(cè)定PAEs降解液的表面活性。
　　 結(jié)論：赤紅球菌L4對(duì)PAEs的降解有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，在最適宜條件下降解效果最好。在最

9、佳降解條件下，赤紅球菌L4對(duì)不同初始濃度的PAEs的降解可以用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程來描述。在降解過程中，較短側(cè)鏈的PAE 被優(yōu)先利用。
　　 赤紅球菌L4 能產(chǎn)生降低水－油表面張力的表面活性物質(zhì)，具有乳化能力，有利于生物降解。較寬的利用譜和較強(qiáng)的抗毒性意味著赤紅球菌L4在環(huán)境污染的生物修復(fù)中具有較大的應(yīng)用潛力。
　　 第四部分：赤紅球菌L4代謝PAEs的機(jī)理探討
　　 目的：應(yīng)用化學(xué)分離、分析技術(shù)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法探

10、討赤紅球菌L4降解PAEs的機(jī)理。
　　 方法：以初始濃度為300 mg/L的DEP 實(shí)驗(yàn)水樣為對(duì)象，投加赤紅球菌L4進(jìn)行降解試驗(yàn)，分別于降解24h，48h，72h，96h時(shí)收集降解液，用C18 固相萃取柱吸附其中的有機(jī)物并用二氯甲烷進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行GC/MS檢測(cè)。用堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳確定其分子量大小。將赤紅球菌L4用普通營養(yǎng)肉湯連續(xù)傳代5次，收集菌體作為對(duì)照組；經(jīng)傳代的細(xì)菌置于總濃度為300

11、mg/L的DMP、DEP、DBP混合溶液中培養(yǎng)24 h，收集菌體作為誘導(dǎo)組。用超聲波裂解誘導(dǎo)組和對(duì)照組細(xì)菌，離心后取上清，即為提取的細(xì)菌總蛋白（酶）。以不同濃度的小牛血清溶液作為標(biāo)準(zhǔn)系列，用Bradford法測(cè)定各組蛋白含量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，等量投加對(duì)照組和誘導(dǎo)組蛋白酶至20 μmol/L的鄰苯二酚溶液，用分光光度法于260 nm和375 nm處分別測(cè)定上述溶液吸光度每分鐘的變化值，即可求得鄰苯二酚1，2-雙加氧酶（C12O）和鄰苯二

12、酚2，3－雙加氧酶（C23O）的酶活性；用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)對(duì)照組和誘導(dǎo)組細(xì)菌總蛋白進(jìn)行分析。
　　 結(jié)論：在降解初始階段，赤紅球菌L4首先水解其中一個(gè)酯鍵，生成鄰苯二甲酸單乙酯，然后繼續(xù)水解另外一個(gè)酯鍵，生成鄰苯二甲酸，后者為主要的中間產(chǎn)物。赤紅球菌L4體內(nèi)擁有至少3條較大的質(zhì)粒；鄰苯二酚雙加氧酶是赤紅球菌L4降解過程中的關(guān)鍵性蛋白酶。赤紅球菌L4 經(jīng)誘導(dǎo)后可同時(shí)表達(dá)C12O和C23O，但C12O活性增加更為明顯。
　

13、　 第五部分：固定化微生物對(duì)水中PAEs的降解
　　 目的：比較固定化微生物和游離微生物對(duì)水中PAEs的降解效果。
　　 方法：以10%的PVA和0.5%海藻酸鈉溶液為包埋劑，以4%的活性炭為吸附劑，以飽和硼酸溶液作為交聯(lián)劑，采用吸附－包埋法制備固定化微生物小球。配制含DMP、DEP、DBP的實(shí)驗(yàn)水樣（300mg/L），以等生物量法，分別將固定化微生物小球或游離細(xì)菌投加于其中，然后置于35 ℃、115 rpm 搖床上進(jìn)

14、行降解試驗(yàn)，測(cè)定48 h、72 h的殘留量以評(píng)價(jià)固定化微生物和游離細(xì)菌的降解效果。
　　 結(jié)論：以10%的PVA和0.5%海藻酸鈉作為包埋劑，以4%的活性炭作為吸附劑可以制備出降解效果良好的固定化微生物小球；固定化微生物對(duì)PAEs的降解效果優(yōu)于游離微生物降解。
　　 第六部分：PAEs生物降解前后的類雌激素活性的比較
　　 目的：對(duì)PAEs混合物生物降解過程中的殘留物進(jìn)行類雌激素活性檢測(cè)，以評(píng)價(jià)降解的安全性。

15、r>　　 方法：用重組酵母菌雌激素檢測(cè)系統(tǒng)（Yeast Estrogen Screen，YES）對(duì)各樣品進(jìn)行檢測(cè)。將含有人雌激素受體的重組酵母菌檢測(cè)液和稀釋成一定濃度梯度的DMP、DEP和DBP的單一及混合物在96孔板中培養(yǎng)，以17 β－雌二醇作為陽性對(duì)照，以CPRG（黃色）作為指示劑，培養(yǎng)3天后，若受試物具有雌激素活性，則溶液由黃色變成紅色，紅色的深淺代表酶活性強(qiáng)度，用酶標(biāo)儀在540 nm 處予以測(cè)定（OD540）。用赤紅球菌L4對(duì)

16、初始總濃度為300 mg/L的DMP、DEP和DBP混合水樣進(jìn)行生物降解，收集降解0h、24h、48h、72h、96h后的降解液，用二氯甲烷液液萃取提取其中的有機(jī)物。用YES對(duì)其進(jìn)行類雌激素活性檢測(cè)。
　　 結(jié)論：YES 試驗(yàn)可以檢測(cè)DMP，DEP，DBP 及其混合物的類雌激素活性，就單一物質(zhì)而言，DMP、DEP、DBP的類雌激素活性由強(qiáng)至弱依次為DEP＞DMP＞DBP，混合PAEs的類雌激素活性主要由DEP所致；赤紅球菌L4降