花椒品質(zhì)評價方法及其應(yīng)用研究.pdf

1、花椒(Pericarpium Zanthoxyli)在我國資源豐富，且生物活性成分種類繁多，藥理活性廣泛。隨著花椒藥用價值，如消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、抑微生物作用、抗癌作用等研究以及化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用，花椒將不會停留在食品、香精香料等行業(yè)中，其他領(lǐng)域也將有著巨大的潛力和深遠(yuǎn)的意義。但我國對花椒基礎(chǔ)性研究不夠。如對不同品種、不同成熟度，同一品種產(chǎn)于不同地區(qū)的花椒有效成分缺乏系統(tǒng)深入的研究，這對花椒的精深加工和拓展應(yīng)用領(lǐng)域極為不利?；?/p>

2、椒現(xiàn)行質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)中等級評定方法缺乏準(zhǔn)確性和客觀性，無法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和定量化；標(biāo)準(zhǔn)評定指標(biāo)單一，能反映花椒內(nèi)在質(zhì)量的指標(biāo)只有揮發(fā)油含量這一項(xiàng)，用這唯一指標(biāo)來評價花椒的質(zhì)量欠缺科學(xué)性和全面性。因此要深入研究花椒指標(biāo)性成分，采用單一評價和整體評價方法相結(jié)合，對花椒進(jìn)行相對宏觀的質(zhì)量考察，建立有效完整的品質(zhì)評價方法。
　　 本文以花椒為原料，利用現(xiàn)代有效成分分離純化技術(shù)，結(jié)合儀器鑒定及分析測試技術(shù)，對花椒中麻味物質(zhì)進(jìn)行了分離、純化和鑒定

3、，并建立了花椒中麻味物質(zhì)HPLC定量測定方法；深入研究了花椒中揮發(fā)油近紅外光譜測定、總生物堿紫外分光光度法測定、花椒檸檬烯及芳樟醇GC測定、花椒香氣成分分析等方法，并進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)考察；采用原子熒光分光光度法、原子吸收分光光度法等常規(guī)方法對花椒中重金屬指標(biāo)進(jìn)行了測定；利用指紋圖譜技術(shù)建立了花椒揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜及花椒HPLC指紋圖譜，并經(jīng)過嚴(yán)格的方法學(xué)考察；依據(jù)上述建立的化學(xué)成分測定方法及指紋圖譜評價等花椒品質(zhì)評價方法，并結(jié)合色

4、差儀分析花椒外觀色澤和顯微鏡觀察花椒粉末特征，充分挖掘數(shù)據(jù)信息，系統(tǒng)分析了不同品種、不同產(chǎn)地、不同采收時期花椒內(nèi)在品質(zhì)的差異性，并采用GC-MS質(zhì)譜和高分辨率飛行時間質(zhì)譜分別對揮發(fā)油ＧC-MS和HPLC指紋圖譜中差異性色譜峰進(jìn)行了鑒定。本文立足于花椒品質(zhì)評價方法的建立及應(yīng)用，為花椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及其開發(fā)利用提供了依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.建立了花椒麻味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)對照品制備技術(shù)及其HPLC定量測定方法：
　　 (

5、1)花椒麻味物質(zhì)的分離純化流程：花椒→花椒油樹脂→麻味物質(zhì)粗分離→逆流干柱層析→合并浸提液→硅膠色譜柱層析→熱石油醚溶解→低溫冷凍結(jié)晶→制備型液相色譜純化→熱石油醚溶解→低溫冷凍結(jié)晶→花椒麻味物質(zhì)純品
　　 (2)分析經(jīng)制備型色譜分離純化得到的P1、P2、P3純度，用薄層色譜法鑒定，均只出現(xiàn)一個斑點(diǎn)，而用氣相色譜歸一化分析，純度分別為75.25％、81.04％、72.13％；GC-MS分析純度最高的P2晶體，分子離子峰質(zhì)荷比均為

6、263，依據(jù)碎片信息及參考文獻(xiàn)，確定P2為花椒中的不飽和脂肪酰胺類物質(zhì)。
　　 (3)高分辨率質(zhì)譜TOF-MS對純度最高的P2晶體進(jìn)行分析，總離子色譜圖中出現(xiàn)的三個峰經(jīng)TOF提取離子計(jì)算，分子量基本一致，為263.2，并推算化合物元素組成為C16H25NO2，不飽和度為5，同位素分布及豐度比與理論值一致，初步推斷為羥基-α-山椒素或羥基-β-山椒素及其同分異構(gòu)體。
　　 (4)建立高效液相色譜法測定花椒中麻味物質(zhì)含量，方

7、法線性范圍為0～250μg/mL，回歸方程為y=45.35x+31.7(R2=0.9977)；花椒麻味物質(zhì)加樣回收率為96.10％(RSD=5.91％，n=6)，回收率良好；方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，但樣品6h后測試不穩(wěn)定，需低溫下延長測試時間或盡快測試，最低檢測濃度為0.1μg/mL。
　　 2.建立了花椒其他特征化學(xué)成分的測定方法：
　　 (1)近紅外光譜法測定花椒中的揮發(fā)油，掃描分辨率為16cm-1，掃描次數(shù)為128

8、時，所得掃描光譜建立的定標(biāo)模型對驗(yàn)證集中的20個樣品進(jìn)行預(yù)測，決定系數(shù)達(dá)到0.973，RMSEP達(dá)到0.272，RPD為6.28，模型預(yù)測能力最好，能夠較準(zhǔn)確地檢測完整花椒顆粒中揮發(fā)油的含量。
　　 (2)花椒中檸檬烯、芳樟醇含量的測定方法，檸檬烯線性范圍為0.4765～9.5300mg/mL，回歸方程為Y=306213X-8925.9(r=0.9997，n=7)；芳樟醇線性范圍為1.0535～23.1300mg/mL，回歸方程

9、Y=225875X+25659(r=0.9994，n=8)。所建立的方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好，加樣同收率高，方法可行，可用于花椒質(zhì)量的定量控制。
　　 (3)試驗(yàn)中建立的酸性染料比色法測定花椒中總生物堿含量，線性范圍為0.2～1.0mg，同歸方程為y=0.917x-0.00188(r=0.9932)，且方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，加樣回收率高，方法可控。
　　 (4)優(yōu)化比較花椒中五種元素的測定方法，方法線性好，回收率在71％～

10、102％之間，符合痕量分析的要求，并用建立方法測定國家級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)楊樹葉中的各元素，結(jié)果各元素測定值均在允許值范圍內(nèi)，表明方法可用于花椒中重金屬的控制。
　　 3.建立了花椒揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜技術(shù)研究：
　　 (1)建立的花椒揮發(fā)油指紋圖譜分析方法，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，方法可行，符合指紋圖譜評價技術(shù)的要求。
　　 (2)建立的青花椒揮發(fā)油GC-MS特征指紋圖譜中共有10個共有峰，青花椒(1-16號樣品)

11、揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的相似度都不低于0.97，說明各地所產(chǎn)青花椒主要峰群的整體圖貌基本一致，質(zhì)量較穩(wěn)定，相似度較高。
　　 (3)建立的紅花椒揮發(fā)油GC-MS特征指紋圖譜中共有11個共有峰，紅花椒(18-33號樣品)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的相似度除18、19、20號甘肅產(chǎn)紅花椒相似度較低外，其他紅花椒具有較高相似度，說明各地所產(chǎn)紅花椒主要峰群的整體圖貌基本一致，質(zhì)量較穩(wěn)定，但存在個別地區(qū)性差別。
　　 4.建立了花

12、椒HPLC指紋圖譜技術(shù)研究：
　　 (1)建立的花椒HPLC指紋圖譜方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，符合指紋圖譜評價技術(shù)要求。
　　 (2)通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》(研究版)提取青花椒HPLC圖譜共有模式，組成HPLC特征指紋圖譜并計(jì)算各批次樣品的相似度，結(jié)果特征指紋圖譜中有9個共有峰，18批青花椒樣品相似度都很低，相似度為0.52～0.67之間，表明不同產(chǎn)地青花椒內(nèi)在品質(zhì)差異性很大。
　　

13、 (3)通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》(研究版)提取紅花椒HPLC圖譜共有模式，組成HPLC特征指紋圖譜并計(jì)算各批次樣品的相似度，結(jié)果特征指紋圖譜中有11個共有峰，15批紅花椒樣品中，除樣品(甘肅秦安縣郭家鎮(zhèn)寺咀村大油椒，編號29)樣本外，其他十四批樣品相似度均大于0.97，表明不同產(chǎn)地紅花椒內(nèi)在品質(zhì)很相似。
　　 5.結(jié)合花椒色澤及粉末顯微特征，利用上述建立方法對花椒內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行評價：
　　 (1)青花椒

14、和紅花椒的揮發(fā)油與麻味物質(zhì)含量變異系數(shù)均較小(均小于5％)，表明兩個品質(zhì)指標(biāo)相對比較穩(wěn)定；青花椒揮發(fā)油含量均值約為紅花椒的2.4倍，分別為5.278mL/100g和2.211mL/100g，而麻味物質(zhì)含量均值約為紅花椒的1.6倍，分別為14.797mg/g和9.390mg/g；從揮發(fā)油和麻味物質(zhì)兩個特征指標(biāo)來看，青花椒品質(zhì)優(yōu)于紅花椒。
　　 (2)青花椒、紅花椒的揮發(fā)油和麻味物質(zhì)含量兩個特征指標(biāo)與其顏色四個指標(biāo)(△L、△A、△B

15、、△E)之間無顯著相關(guān)性；青花椒揮發(fā)油和麻味物質(zhì)含量兩個指標(biāo)之間有極顯著正相關(guān)(P≤0.01)，而紅花椒揮發(fā)油和麻味物質(zhì)含量兩個指標(biāo)之間無顯著相關(guān)；不同產(chǎn)地青花椒揮發(fā)油和麻味物質(zhì)之間都存在顯著性差異(P≤0.05)，而不同產(chǎn)地紅花椒麻味物質(zhì)之間不存在顯著性差異，而揮發(fā)油含量有顯著性差異(P≤0.05)。
　　 (3)青花椒、紅花椒中檸檬烯、芳樟醇、生物堿含量都不穩(wěn)定，含量變異系數(shù)大，均超過25％；由檸檬烯指標(biāo)來看，青花椒平均值為

16、12.89 mg/g，而紅花椒平均值為14.04mg/g，經(jīng)顯著性差異分析，青花椒與紅花椒之間無顯著性差異(P＞0.05)；由芳樟醇指標(biāo)來看，青花椒平均值為72.53mg/g，而紅花椒平均值為7.94 mg/g，經(jīng)顯著性差異分析，青花椒與紅花椒之間存在極顯著性差異(P≤0.01)；由生物堿指標(biāo)來看，青花椒平均值為1.44％，而紅花椒平均值為0.96％，經(jīng)顯著性差異分析，紅花椒與青花椒之間存在顯著性差異(P≤0.05)。
　　 (

17、4)重慶江津青花椒在6月8日左右采收，香氣成分信息比較豐富，麻味物質(zhì)含量最高，為13.65mg/g，但揮發(fā)油含量不是最高，為4.22mL/100g。
　　 (5)青花椒揮發(fā)油共有峰中，萜烯類平均占共有峰的41.95％，醇類56.06％，酮類1.99％。紅花椒揮發(fā)油共有峰中，萜烯類平均占共有峰的52.59％，醇類34.50％，酯類12.91％。
　　 (6)青花椒揮發(fā)油經(jīng)聚類分析后，16批樣品聚為4類，這4類青花椒產(chǎn)地分別

18、是四川洪雅藤椒基地、云南昭通、重慶、四川金陽；紅花椒揮發(fā)油經(jīng)聚類分析后，16批樣品也聚為4類，分別是甘肅天水市秦安縣郭家鎮(zhèn)大油椒、甘肅天水市秦安縣和四川阿壩州金川縣、四川汶川縣、四川漢源和涼山州。
　　 (7)四川漢源紅花椒相似度很好，基本都達(dá)到1，表明在漢源不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植的花椒內(nèi)在品質(zhì)基本一致；而四川金陽青花椒品質(zhì)差異性很大，相似度很低；江津青花椒除一批樣品外，相似度都達(dá)0.97以上。
　　 (8)紅花椒和青花椒HPLC