動(dòng)物源性食品中三聚氰胺殘留的ELISA和IAC-HPLC檢測(cè)方法的研究.pdf

1、本研究合成3-(4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-基硫代)丙酸作為三聚氰胺半抗原，分別與牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)得到免疫抗原和包被抗原。用合成的免疫原免疫動(dòng)物，制備了高效價(jià)的抗三聚氰胺血清。血清經(jīng)確證后建立了檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。并將血清純化，偶聯(lián)經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B制備三聚氰胺免疫親和柱層析柱，測(cè)定了免疫親和層析柱對(duì)三聚氰胺的柱容量、回收率及重復(fù)使用性，建立

2、了檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺殘留的免疫親和層析-高效液相色譜檢測(cè)方法。結(jié)果如下:
　　1、三聚氰胺氰胺特異性抗體的制備
　　利用三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物2-氯-4，6-二-氨基-1，3，5-三嗪與3-巰基丙酸在堿性環(huán)境下反應(yīng)成半抗原3-(4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-基硫代)丙酸，經(jīng)紅外光譜和質(zhì)譜法鑒定合成成功。將半抗原分別與牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備免疫抗原Mel-BSA和Mel-OVA，經(jīng)紫外

3、光譜法鑒定偶聯(lián)成功，經(jīng)計(jì)算Mel-BSA、Mel-OVA的半抗原結(jié)合比為12.6∶1，6.5∶1。將Mel-BSA作為免疫原免疫實(shí)驗(yàn)兔制備抗血清。以Mel-OVA為包被原，利用間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，制備的抗血清效價(jià)為1∶23×103。
　　2、三聚氰胺ELISA檢測(cè)方法的建立
　　包被抗原與抗血清的最佳工作濃度分別為1μg/ml和1∶2000。用抗三聚氰胺血清建立了三聚氰胺的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，三聚氰胺抑制

4、抗血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-0.3494x+1.1872，半數(shù)抑制量為92.64ng/mL最低檢測(cè)限為3.89ng/mL,線性范圍為3.89～500ng/mL，其靈敏度符合目前對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)需要。檢測(cè)抗體的特異性，除環(huán)丙氨嗪外，與三聚氰酸、四環(huán)素、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、氨芐青霉素沒有交叉反應(yīng)，說明抗血清的特異性良好。該檢測(cè)方法的精密度符合要求，批內(nèi)變異系數(shù)在5.23％以內(nèi)，批間變異系數(shù)在10.13％以內(nèi)。添加濃度在

5、10～400ng/ml范圍，三聚氰胺在牛奶、雞蛋中的添加回收率分別在78.60～92.38％和79.43～90.82％，達(dá)到了ELISA方法對(duì)準(zhǔn)確度的要求。
　　3、三聚氰胺IAC-HPLC檢測(cè)方法的建立
　　將制備的三聚氰胺特異性抗血清經(jīng)飽和硫酸銨法提純。將純化的蛋白與CNBr活化的Sepharose4B偶聯(lián)，偶聯(lián)率達(dá)到90.8％，裝柱得到三聚氰胺特異性IAC柱。采用HPLC檢測(cè)方法對(duì)IAC柱進(jìn)行評(píng)價(jià)，IAC對(duì)三聚氰胺的動(dòng)

6、態(tài)柱容量為1046.3±17.2 ng/mL，絕對(duì)柱容量為121.5ng/mg IgG。以IAC柱為樣品凈化手段建立了牛奶和雞蛋中三聚氰胺殘留量的IAC-HPLC檢測(cè)方法，在本研究的色譜條件下，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液在50-5000ng/ml范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系(R2≥0.999)。牛奶和雞蛋中三聚氰胺添加濃度為30，400，1000ng/mL時(shí)，回收率分別在86.92～95.29％和82.83～95.82％之間。牛奶和雞蛋樣品中三聚