基于納米材料新型電化學(xué)傳感器的制備及其在生物樣品分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了信息技術(shù)與生物技術(shù)，涉及化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)以及電子學(xué)等學(xué)科。由于其具有體積小、分辨率高、響應(yīng)時(shí)間短、所需樣品少、對(duì)活細(xì)胞損傷小等特點(diǎn)，電化學(xué)生物傳感器在醫(yī)藥工業(yè)、食品檢測(cè)和環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。近年來，隨著材料科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，納米材料因具有特殊的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，如小尺寸效應(yīng)、表面界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)及介電限域效應(yīng)等，使其在許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前，采用納米材料構(gòu)建

2、新型的電化學(xué)生物傳感器日益成為研究熱點(diǎn)。納米材料應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域后，不僅提高了傳感器的檢測(cè)性能，而且使傳感器的化學(xué)和物理性質(zhì)以及它對(duì)生物分子或者細(xì)胞的檢測(cè)靈敏度大幅提高，檢測(cè)時(shí)間也得以縮短，并且可實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)時(shí)分析檢測(cè)。
　　 本論文的工作主要集中在將納米技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了基于納米材料的新型電化學(xué)生物傳感器并將其用于檢測(cè)水體中大腸桿菌和細(xì)胞表面的多聚糖。該傳感技術(shù)為水體中大腸桿菌的快速檢測(cè)提供了新方法

3、，同時(shí)也為腫瘤疾病的早期診斷及治療提供了新途徑。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 第-部分：Cu@Au復(fù)合納米粒子標(biāo)記抗體的電化學(xué)免疫方法用于水體中大腸桿菌的快速檢測(cè)
　　 本文制備了Ca@Au復(fù)合納米粒子，并將其用于標(biāo)記大腸桿菌抗體，利用電化學(xué)免疫技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水體中大腸桿菌的快速檢測(cè)。Cu@Au復(fù)合納米粒子具有優(yōu)良的生物相容性、電化學(xué)活性和穩(wěn)定性。與單獨(dú)的金納米顆粒相比，Cu@Au復(fù)合納米粒子作為抗體標(biāo)記物大幅提高了電化學(xué)檢測(cè)

4、的靈敏度。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先將大腸桿菌吸附在聚苯乙烯修飾的ITO導(dǎo)電玻璃表面，利用抗體和大腸桿菌之間的免疫反應(yīng)把Cu@Au復(fù)合納米粒子標(biāo)記的抗體結(jié)合在ITO導(dǎo)電玻璃表面。將Cu@Au復(fù)合納米粒子在溴氫酸中氧化為離子形式，然后用陽極溶出伏安法定量檢測(cè)溶液中的Cu2+。為了提高檢測(cè)靈敏度，采用Nafiob/貢膜修飾的玻碳電極(GCE/Nafion/Hg)作為工作電極，Cu2+的檢測(cè)限可達(dá)9.0×10-12 M。結(jié)果表明，在50 cfu/mL

5、～5.0×104 cfu/mL濃度范圍內(nèi)，銅的響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為30 cfu/mL，總的分析時(shí)間為2 h。將研究的電化學(xué)免疫方法用于地表水中大腸桿菌的測(cè)定，通過對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行預(yù)富集，能夠檢測(cè)到大腸桿菌的濃度為3 cfu/10 mL。
　　 第二部分：基于磁性高分子微球的電化學(xué)DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測(cè)
　　 本文研制了一種新型的基于磁性高分子微球的電化學(xué)DNA生物傳感器，并將其

6、用于水體中大腸桿菌的檢測(cè)。以海藻酸包裹鈷的磁性高分子微球作為DNA探針的固體基質(zhì)，根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)甜uid A基因合成了特異性的DNA序列，制備了用于大腸桿菌檢測(cè)的DNA探針。利用透射電鏡技術(shù)對(duì)制備的磁性高分子微球進(jìn)行了表征，并通過紅外光譜法證實(shí)了特定DNA序列與磁性高分子微球的成功連接。在DNA雜交前后，分別對(duì)嵌入式雜交指示劑柔紅霉素進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的變化對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)。采用非互補(bǔ)DNA序列、三個(gè)堿基錯(cuò)配的DN

7、A序列及完全互補(bǔ)DNA序列驗(yàn)證了DNA探針的選擇性。實(shí)驗(yàn)過程中利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)提取了大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)uid A基因片斷，并用電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)經(jīng)過熱處理后的PCR產(chǎn)物和水體中大腸桿菌進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，本文研制的電化學(xué)DNA生物傳感器可以檢測(cè)到0.30 nM完全互補(bǔ)DNA序列和0.50 ng/μL的PCR產(chǎn)物，對(duì)大腸桿菌的檢出限為50 cfu/mL。
　　 第三部分：基于二茂鐵修飾氧化鋅納米棒的信號(hào)放大策略

8、用于水體中大腸桿菌的電化學(xué)免疫檢測(cè)
　　 本文將大腸桿菌檢測(cè)抗體(dAb)和二茂鐵(Fc)共同修飾于氧化鋅納米棒(ZnO NRs)表面制備了{(lán)dAb-ZnO-Fc}生物復(fù)合物，并將其用于水體中大腸桿菌的電化學(xué)免疫檢測(cè)。采用BCA蛋白測(cè)定法(BCA protein assay)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)分別對(duì)檢測(cè)抗體和二茂鐵在氧化鋅納米棒上的最優(yōu)配比進(jìn)行了研究。該生物復(fù)合物利用二茂鐵作為電活性物質(zhì)產(chǎn)生電信號(hào)

9、，檢測(cè)抗體用于免疫結(jié)合大腸桿菌。采用“三明治”夾心結(jié)構(gòu)，首先將捕獲抗體固定在巰基乙酸修飾的金電極表面，然后通過免疫反應(yīng)結(jié)合大腸桿菌，進(jìn)而吸附{dAb-ZnO-Fc)生物復(fù)合物，最后用示差脈沖伏安法測(cè)定固定在電極表面上的二茂鐵。通過分析檢測(cè)不同濃度大腸桿菌溶液獲得的電流信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1.0×102 cfu/mL～1.0×106 cfu/mL濃度范圍內(nèi)，二茂鐵的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，

10、檢出限為50cfu/mL。通過對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行富集濃縮，該電化學(xué)免疫技術(shù)可以檢測(cè)到5 cfu/10mL大腸桿菌。
　　 第四部分：巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞表面多聚糖的競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)
　　 本文合成了巰基糖衍生物用于構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用競(jìng)爭(zhēng)策略檢測(cè)活體腫瘤細(xì)胞表面多聚糖的表達(dá)水平。該傳感器利用納米金/碳納米管修飾玻碳電極(GCE/MWNT/AuNP)為基底，通過Au-S鍵固定巰基糖衍生物。此外，采

11、用碳納米管為載體固定辣根過氧化酶(HRP)和刀豆球蛋白(Con A)制備了{(lán)ConA-MWNT-HRP}生物復(fù)合物。以人體肺、肝、前列腺組織中活體腫瘤細(xì)胞表面甘露糖為研究對(duì)象，利用甘露糖和刀豆球蛋白的特異性結(jié)合，傳感器表面的巰基糖衍生物與細(xì)胞表面的甘露糖競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合{Con A-MWNT-HRP}生物復(fù)合物。以對(duì)苯二酚為電子媒介體，通過測(cè)定辣根過氧化酶催化過氧化氫產(chǎn)生的響應(yīng)電流對(duì)活細(xì)胞表面的多聚糖進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，本方

12、法用于腫瘤細(xì)胞的定量檢測(cè)具有寬的線性范圍和低的檢測(cè)限。同時(shí)，我們計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞表面甘露糖的數(shù)目：每個(gè)肺癌細(xì)胞A549含有甘露糖的數(shù)目為5.8×1010個(gè)，每個(gè)肝癌細(xì)胞QGY-7703含有甘露糖的數(shù)目為1.3×1010個(gè)，每個(gè)前列腺癌細(xì)胞LNCaP含有甘露糖的數(shù)目為1.9×1010個(gè)。本文所研制的巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器用于甘露糖的測(cè)定具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)信號(hào)快等優(yōu)點(diǎn)，為活細(xì)胞表面多聚糖的檢測(cè)提供了新的方法。
　

13、　 第五部分：凝集素電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞表面多聚糖的檢測(cè)研究
　　 本文制備了一種高靈敏度和高選擇性的凝集素(lectins)生物傳感器并將其用于檢測(cè)甘露糖(mqnnose)和唾液酸(sialic acid)在人體肺、肝、前列腺組織中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平。采用碳納米管/納米金(MWNT/AuNP)修飾電極固定凝集素，利用細(xì)胞表面的多聚糖(glycans)和凝集素之間的特異性相互作用將細(xì)胞吸附在傳感器表面

14、，然后結(jié)合硫堇(Th)包被金納米粒子標(biāo)記的凝集素{lectin-Au-Th}構(gòu)建“三明治”夾心結(jié)構(gòu)。最后用示差脈沖伏安法(DPV)定量檢測(cè)硫堇，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞表面多聚糖的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘露糖在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平普遍較高；唾液酸在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平要明顯高于其在正常細(xì)胞表面的表達(dá)，研究結(jié)果對(duì)于揭示腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)，依據(jù)腫瘤細(xì)胞表面唾液酸與接骨木凝集素(SNA)的特異性相互作用，將該電化學(xué)生