新型電化學(xué)生物傳感技術(shù)的研究及納米材料在其中的應(yīng)用.pdf

1、電化學(xué)生物傳感技術(shù)由于所需儀器簡(jiǎn)單、選擇性好、分析速度快、檢測(cè)成本低、易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。如何利用電化學(xué)生物傳感技術(shù)快速、靈敏檢測(cè)疾病標(biāo)志物以及環(huán)境中重金屬離子,是當(dāng)前醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)中既新穎又極具吸引力的熱門研究課題之一。但是傳統(tǒng)電化學(xué)生物傳感器存在靈敏度較低,響應(yīng)速度慢以及穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)。近年來,納米材料的出現(xiàn)為解決這些問題提供了新的思路。將納米材料應(yīng)用到電化學(xué)生物傳感器中

2、,由于其獨(dú)特的性質(zhì)可提高傳感器的響應(yīng)性能,已成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。此外,針對(duì)當(dāng)前有機(jī)小分子和其結(jié)合蛋白相互作用檢測(cè)中存在的問題,將這種特異性的相互作用轉(zhuǎn)換成對(duì)小分子標(biāo)記的DNA檢測(cè),由于DNA檢測(cè)方法的多樣性,因此這種分析方法有望用于臨床藥物篩選和靶蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)。本論文針對(duì)這些問題,發(fā)展了一系列成本低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的新型電化學(xué)生物傳感技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè)。其主要內(nèi)容如下:
　　 (1)碳納米管(CNTs)由于

3、具有比表面積大、導(dǎo)電性強(qiáng)、電催化活性高等優(yōu)點(diǎn),因而在電化學(xué)生物傳感技術(shù)領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。為了進(jìn)一步拓寬CNTs在電化學(xué)生物分析中的應(yīng)用范圍,在第2章發(fā)展了一種新型的、基于磷脂修飾MWNTs(PL/MWNTs)作為電化學(xué)標(biāo)記物的電化學(xué)免疫傳感技術(shù)。在該方法中,首先,通過非共價(jià)作用在MWNTs表面修飾磷脂分子,再利用磷脂分子末端的氨基共價(jià)交聯(lián)單克隆抗體,這樣便得到了PL/MWNTs電化學(xué)標(biāo)記物。再通過傳統(tǒng)的磁分離免疫夾心反應(yīng)富集收集這

4、種標(biāo)記物,當(dāng)沉積到十八烷基硫醇絕緣膜修飾的電極表面后,由于碳納米管的隧道效應(yīng)改變了絕緣膜的性質(zhì),產(chǎn)生了電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這種新型的電化學(xué)免疫傳感技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)的高靈敏、高特異性檢測(cè),響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍為5 pg/mL到100ng/mL,檢測(cè)限為3 pg/mL,而且還能對(duì)人血清樣品中PSA進(jìn)行檢測(cè)。該方法靈敏度高、選擇性好、成本低,并可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
　　 (2)鑒于上述發(fā)展的新型電化

5、學(xué)免疫傳感技術(shù)的高靈敏性和高特異性,為了拓寬這種技術(shù)在DNA分析中的應(yīng)用范圍,在第3章建立了一種基于單鏈DNA修飾MWNTS(ssDNA/MWNTs)作為電化學(xué)標(biāo)記物磁分離檢測(cè)DNA的電化學(xué)傳感技術(shù)。在這種分析方法中,通過非共價(jià)作用可將ssDNA修飾到MWNTs表面,這不僅能使MWNTs穩(wěn)定地分散水溶液中,同時(shí)又能使修飾在MWNTs表面DNA與目標(biāo)DNA發(fā)生雜交反應(yīng)。另外為了提高堿基錯(cuò)配識(shí)別的能力,在磁性納米顆粒表面修飾了發(fā)夾探針。當(dāng)目

6、標(biāo)DNA存在時(shí),磁珠表面的發(fā)夾探針構(gòu)象發(fā)生變化,莖部雙鏈結(jié)構(gòu)變?yōu)槿嵝詥捂溄Y(jié)構(gòu),再通過傳統(tǒng)的磁分離DNA夾心反應(yīng)可以選擇性收集ssDNA/MWNTs標(biāo)記物,當(dāng)吸附到十八烷基硫醇絕緣膜修飾的電極表面后,產(chǎn)生了二茂鐵的氧化還原峰電流。該方法對(duì)目標(biāo)DNA濃度檢測(cè)的動(dòng)態(tài)線性范圍為1pM～500 nM,檢測(cè)限可達(dá)0.9 pM。另外還可利用此方法對(duì)乙肝病毒特異性序列突變情況進(jìn)行檢測(cè),使得突變型和野生型得到了很好的區(qū)分。
　　 (3)鑒于上述兩

7、個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中,磁分離盡管可以富集收集電化學(xué)標(biāo)記物MWNTs,但是磁性納米顆粒也會(huì)增加背景電流,同時(shí)為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化上述實(shí)驗(yàn)操作步驟,因此在第4章中又發(fā)展了一種基于MWNTs作為電化學(xué)標(biāo)記物通過鏈置換反應(yīng)檢測(cè)特定DNA序列的電化學(xué)生物傳感技術(shù)。在這種分析方法中,由于雙鏈互補(bǔ)DNA雜交反應(yīng)的結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA與MWNTs作用力,因此當(dāng)有目標(biāo)DNA存在時(shí)會(huì),修飾在MWNTs表面的ssDNA會(huì)從MWNTS表面解離出來,MWNTs繼而沉積到巰基十

8、六酸修飾的電極表面,產(chǎn)生了電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。而當(dāng)沒有目標(biāo)DNA鏈存在時(shí),由于修飾在MWNTs表面的DNA在中性溶液中會(huì)與修飾在電極表面的巰基十六酸產(chǎn)生靜電排斥作用,致使MWNTs不能吸附在電極表面,降低了背景,因而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的靈敏、快速檢測(cè),其線性范圍在10 pM～100 nM之間,檢測(cè)下限為5 pM。
　　 (4)在第5章中,將MWNTs電化學(xué)標(biāo)記物鏈置換反應(yīng)和Hg2+能特異性識(shí)別特定堿基對(duì)T-T結(jié)合起來,實(shí)現(xiàn)了污水中H

9、g2+的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)考察了鹽離子濃度、置換反應(yīng)的溫度以及干擾離子對(duì)此分析方法性能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此傳感技術(shù)的電流響應(yīng)與Hg2+濃度在20 nM～10μM范圍成良好的準(zhǔn)線性關(guān)系,檢測(cè)下限10 nM。
　　 (5)有序三維結(jié)構(gòu)的納米材料不僅為酶的固定提供了大量的活性位點(diǎn)和良好的微生物環(huán)境,同時(shí)它還能保證酶與底物之間盡可能有較大的接觸面積,從而提高它在生物傳感器應(yīng)用中的響應(yīng)性能。在第6章中,將聚碳酸酯膜固定到玻碳電極表面,通過恒電

10、位沉積法制備了釕紫納米線陣列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),釕紫納米線陣列修飾的玻碳電極在低電位下對(duì)過氧化氫有良好的響應(yīng)性能。另外當(dāng)把葡萄糖氧化酶固定到釕紫納米線陣列的表面后,葡萄糖氧化酶依然能保持良好的生物活性,因此通過此方法得到了性能良好的葡萄糖傳感器。
　　 (6)層狀材料由于具有層間距可調(diào)的性質(zhì),因此可往其層間插入各種各樣不同尺寸大小的化合物。再加上這類無機(jī)化合物具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性、比表面積大、表面電荷密度高等優(yōu)點(diǎn),可適用

11、于蛋白質(zhì)的固定。在第7章中,提出了一種基于α-磷酸鋯層狀材料負(fù)載葡萄糖氧化酶的電化學(xué)生物傳感器,并將其應(yīng)用到葡萄糖的檢測(cè)中。首先利用直接沉淀法制備了α-磷酸鋯層狀材料,在中性條件下將葡萄糖氧化酶插入到α-磷酸鋯層狀材料中,再通過殼聚糖分散并固定到電極表面。由于α-磷酸鋯層狀材料具有開放的結(jié)構(gòu),可使得葡萄糖氧化酶與底物充分地接觸,從而提高了酶催化反應(yīng)的效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法可實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的快速、靈敏定量檢測(cè),其線性范圍為0.01 m

12、M～20 mM,檢測(cè)下限為0.01mM。
　　 (7)利用小分子標(biāo)記的DNA來檢測(cè)有機(jī)小分子與其結(jié)合蛋白質(zhì)的相互作用是當(dāng)前藥物篩選和靶蛋白檢測(cè)的一種新方法,其原理在于把這種特異性地相互作用轉(zhuǎn)換成對(duì)DNA的分析,同時(shí)由于DNA放大檢測(cè)方法的多樣性,因此使得這種分析方法有望成為研究有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)平臺(tái)。核酸外切酶Ⅰ末端保護(hù)分析就是這種分析方法中的一種,即當(dāng)有機(jī)小分子與其結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合后抑制了ExoI對(duì)其降解,保存