基于納米結(jié)構(gòu)氧化鋅的電化學(xué)生物傳感研究.pdf

1、生物傳感器是在化學(xué)傳感器的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個非?；钴S的研究領(lǐng)域，它與生物信息學(xué)、生物芯片、生物控制論、仿生學(xué)、生物計算機(jī)等學(xué)科一起，處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉區(qū)域。它利用生物活性物質(zhì)的親和性，如酶-底物、酶-輔基、抗原-抗體、激素-受體等的分子識別功能，可以有選擇地檢測待測物，將生物活性物質(zhì)與各種固態(tài)物理傳感器相結(jié)合而形成的一種檢測儀器，具有靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好和進(jìn)行快速在線連續(xù)監(jiān)測等特點(diǎn)，能廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生

2、物、臨床化學(xué)和診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析、過程控制與檢測等領(lǐng)域。無論是對生物電子體系的機(jī)理研究，還是實(shí)際應(yīng)用開發(fā)，生物傳感器都激發(fā)了各國研究者廣泛而持久的興趣。
　　 構(gòu)建生物傳感器有兩個核心問題，一是生物分子的固定化，二是生物分子活性的保持。這對固定生物分子的載體材料提出了很高的要求。
　　 納米尺度的ZnO具有較好的電子傳導(dǎo)能力，具有高等電點(diǎn)（IEP=9.5），與蛋白質(zhì)或者生物細(xì)胞等生物材料有極好的兼容性，安全無毒，很

3、適合用來吸附低等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。這些優(yōu)點(diǎn)是其他納米材料所無法比擬的，完全符合構(gòu)建生物傳感器對載體材料的特殊要求，使其在生物化學(xué)傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用上具有很強(qiáng)的吸引力。
　　 本論文以建立納米結(jié)構(gòu)氧化鋅在生物傳感器方面的應(yīng)用體系為目標(biāo)，將氧化鋅納米材料優(yōu)異的特性應(yīng)用于生物傳感器中。這一體系包括納米結(jié)構(gòu)氧化鋅的制備、生物分子在納米結(jié)構(gòu)氧化鋅表面的組裝、電極的修飾、電化學(xué)及光學(xué)傳感特性測試等研究。具體闡述如下：
　　 一、目前合成Z

4、nO一維納米材料的方法很多，包括氣相傳輸法、金屬有機(jī)氣相外延生長、水熱合成法和電化學(xué)沉積法。其中氣相傳輸法和水熱法是兩種廣泛使用的方法，氣相傳輸法在不同條件下可合成多種形貌的納米結(jié)構(gòu)氧化鋅，而水熱法更有利于得到形貌均一的一維或零維氧化鋅納米結(jié)構(gòu)，如氧化鋅納米棒和氧化鋅量子點(diǎn)。
　　 明白納米ZnO的生長機(jī)制，有效控制其生長過程，進(jìn)而獲得理想的ZnO納米結(jié)構(gòu)作為一個重大課題，目前仍面臨許多難題和挑戰(zhàn)。因此，尋找一種穩(wěn)定生長ZnO納

5、米線的條件是必要的，本章主要研究氣相傳輸法和水熱法控制生長氧化鋅納米棒與氧化鋅量子點(diǎn)及其性質(zhì)。
　　 二、酪氨酸酶（Tyrosinase）是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動植物及人體中。酪氨酸酶主要參與兩個反應(yīng)過程：催化L2酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長2多巴和氧化L2多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列反應(yīng)后，形成黑色素。酪氨酸酶在生物體中具有重要的生理功能。酪氨酸酶的活性中心是由兩個含銅離子位點(diǎn)構(gòu)成。在催化過程中，雙核銅離子位點(diǎn)以3種

6、形態(tài)存在，分別是氧化態(tài)、還原態(tài)和脫氧態(tài)。
　　 酪氨酸酶可以催化單酚和二酚形成的醌類化合物在水溶液中不穩(wěn)定，經(jīng)過一系列催化反應(yīng)，可自身聚合或與其它物質(zhì)（有機(jī)胺類化合物等）聚合反應(yīng)形成不溶于水的大分子物質(zhì)而沉淀。因此酪氨酸酶不僅除去酚類物質(zhì)，還能去除其多種有機(jī)物，如有機(jī)胺、有機(jī)氯化合物等。
　　 ZnO納米棒能吸附負(fù)電性的酶，在Nafion存在時能形成穩(wěn)定的均一分布的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出比純ZnO膜更優(yōu)異的電子傳遞性質(zhì)。

7、吸附在ZnO納米棒上的酪氨酸酶能有效保持其生物活性，對酚類化合物具有優(yōu)異的電化學(xué)響應(yīng)，可用于酚類化合物的測定，同時也為納米生物傳感器的構(gòu)建提供了新的途徑。
　　 三、對金絲電極進(jìn)行預(yù)處理，在金絲電極表面附著一層鋅-金合金，這層鋅-金合金有助于納米氧化鋅棒的成核生長，使納米氧化鋅棒更牢固的生長在金絲電極表面。利用工藝簡單的水熱法把納米氧化鋅棒生長在金絲電極表面。生長的納米氧化鋅棒尺寸均一，通過掃描電子顯微鏡（SEM）和熒光光譜（P

8、L）檢測說明這種方法得到的納米氧化鋅棒結(jié)晶性質(zhì)良好，有利于酪氨酸酶在納米氧化鋅棒上的吸附。SEM、傅利葉紅外吸收光譜（FTIR），和電化學(xué)實(shí)驗(yàn)證明低等電點(diǎn)的酪氨酸酶能大量吸附在高等電點(diǎn)的納米氧化鋅棒上，并且吸附的酪氨酸酶能很好的保持其生物活性。利用這種方法構(gòu)建的傳感器對苯酚顯示了良好的傳感特性，其響應(yīng)時間小于5秒，靈敏度為103.08μA/mM，檢測限為0.623μM。用這種方法構(gòu)建的傳感器還具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，是性能良好的檢測苯

9、酚濃度的新穎的傳感器。
　　 四、辣根過氧化物酶（HRP）是一個含有血紅素蛋白為催化中心的糖蛋白酶，血紅蛋白中包含F(xiàn)e3+/Fe2+氧化還原對。酶的分子質(zhì)量約為42000 Da。由于HRP相對簡單的提純工藝和較低的成本，使HRP在傳感器研究方面有著非常重要的地位。HRP很早就被作為一個典型的酶系統(tǒng)用來研究對過氧化氫的催化的生物特性。
　　 HRP對H2O2的催化循環(huán)是分步進(jìn)行的，F(xiàn)e2+的雙電子氧化，產(chǎn)生一個過渡態(tài)的氧絡(luò)

10、合Ⅸπ雜化離子，過渡態(tài)Ⅰ（HRP-Ⅰ）和過渡態(tài)Ⅱ（HRP-Ⅱ），其中第二個過渡態(tài)是HRP-Ⅰ中的FeⅣ=O中心的單電子還原和π雜化絡(luò)離子的還原得到的。由于對HRP的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理研究的比較成熟，所以HRP已成為一個優(yōu)秀的模板酶用來研究生物催化材料的催化機(jī)理。
　　 用鋅粉為原料用簡單的水熱法在處理過的金絲電極上生長氧化鋅納米棒，在生長在金絲電極上的氧化鋅納米棒上交替組裝負(fù)電性的聚合物聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）和高等電點(diǎn)的HRP構(gòu)建

11、多層辣根過氧化物酶生物傳感器，用于過氧化氫濃度的測定。電化學(xué)、紫外可見吸收光譜（UV-vis）、ζ電位、SEM等測試結(jié)果說明PSS和HRP被穩(wěn)定的層層組裝在氧化鋅納米棒表面，并且HRP在不使用電子媒介體的情況下很好的保持了其生物活性，對H2O2起到了良好的催化作用。多層組裝的HRP生物傳感器在探測H2O2濃度過程中表現(xiàn)出了非常好的傳感性能，具有寬的檢測范圍和低的檢測限，隨著HRP層數(shù)從一層到多層增加，傳感器的靈敏度也相應(yīng)的增加，其中單層

12、HRP的傳感器靈敏度為36.28μA/mM，已優(yōu)于利用HRP進(jìn)行H2O2探測的其他傳感器。
　　 五、Carbohydrate antigen19-9（CA19-9）是胰腺癌的首選標(biāo)志物，并且在其他癌癥的病例中也能檢測到CA19-9的存在，如結(jié)腸癌，胃癌，肝癌等，所以CA19-9被認(rèn)為是一個路易斯活性寡五糖多肽（sialylated Lea-active pentasaccharide）。目前，CA19-9在臨床上難以早期發(fā)現(xiàn)，

13、而且CA19-9所標(biāo)記的腫瘤都具有極高的死亡率，所以，研究CA19-9的免疫分析檢測方法在臨床醫(yī)學(xué)和病理研究方面都具有非常重要的意義。
　　 免疫分析法是以抗原或半抗原和抗體的特異性結(jié)合生成抗原一抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)而建立的分析方法。它的提出及發(fā)展是生物分析化學(xué)最偉大的成就之一。免疫分析法因其良好的選擇性，已廣泛應(yīng)用于臨床監(jiān)測、生化分析、毒物分析、環(huán)境分析和疾病防治等方面。估計全世界每年要進(jìn)行數(shù)億次的免疫分析。目前最為成熟

14、的免疫分析方法是放射免疫分析法，但由于放射性物質(zhì)的毒害，限制了它的應(yīng)用。為了替代放射免疫分析法，靈敏度高的非放射免疫分析法的研究成為免疫分析法的研究熱點(diǎn)。自上世紀(jì)中葉以來，已創(chuàng)立了一系列非放射免疫分析法，如包括酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法、電化學(xué)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。這些技術(shù)使其在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上進(jìn)行抗原和抗體的定位，對各種極微量的生物活性物質(zhì)的超微量測定等達(dá)到了一個新的水平，它們已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物

15、、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域。
　　 氧化鋅納米材料在免疫檢測上的應(yīng)用為生物分子的組裝和分析帶來了新的方向和方法。在經(jīng)過的修飾的金片或硅片等功能化的襯底上通過化學(xué)鍵合的方法連接上抗體，同時在氧化鋅量子點(diǎn)上通過靜電吸附或氫鍵等作用組裝抗體，然后用待測抗原通過生物特異反應(yīng)將量子點(diǎn)上的抗體和襯底底片上的抗體連接到一起，建立抗原分子與量子點(diǎn)之間的數(shù)量關(guān)系，將難以實(shí)現(xiàn)的對抗原的濃度檢測轉(zhuǎn)化為容易實(shí)現(xiàn)的對氧化鋅量子點(diǎn)的檢測。由于對氧化鋅的檢測方法多樣

16、而且成熟，如電化學(xué)分析法和熒光分析法等，所以利用這種過程構(gòu)建的對抗原濃度檢測的免疫傳感器可用多種方法同時進(jìn)行檢測，檢測過程快速，方便，準(zhǔn)確，不需使用昂貴的儀器和繁雜的分析手段。
　　 本文利用簡單的水熱法合成了粒徑均勻，分散性好的氧化鋅量子點(diǎn)。進(jìn)而利用氧化鋅量子點(diǎn)組裝CA19-9抗體，與化學(xué)鍵合在硅襯底上的CA19-9抗體通過CA19-9特異性結(jié)合，將組裝有CA19-9抗體的氧化鋅量子點(diǎn)連接到硅襯底上，將難以實(shí)現(xiàn)的對CA19-9