企鵝珍珠貝Cd-MT酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及試劑盒的初步研制.pdf

1、鎘(Cd)為慢性蓄積性毒物,對腎臟、肺、肝、神經(jīng)系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性,并且具有致癌、致畸和致突變的作用。由于人類的各種活動,特別是近代工業(yè)的發(fā)展,使生存環(huán)境受到了廣泛的Cd污染,工業(yè)“三廢”中排放的Cd對人和動物的危害也日益受到重視。
　　 金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸(Cys)、并能被金屬誘導合成的金屬結(jié)合蛋白。MT的一個顯著的特點就是能在轉(zhuǎn)錄水平上

2、被環(huán)境中的金屬所誘導,其表達水平的高低與環(huán)境中的金屬濃度有直接的關(guān)系。因此,20世紀70年代就有人提出將水生生物體內(nèi)的MT含量作為水環(huán)境污染的生物標志物。雙殼貝類作為底棲生物,它生活在沉積物與水體的界面,通常認為其生物體內(nèi)的重金屬含量與周圍水生環(huán)境污染的程度密切相關(guān),能夠真實反映環(huán)境的污染狀況,因此其體內(nèi)的MT可作為水生環(huán)境重金屬污染的指示物。本研究用CdCl2誘導企鵝珍珠貝合成Cd—MT,并對Cd-MT進行分離純化,制備了兔抗企鵝珍珠

3、貝Cd-MT多克隆抗體,建立Cd-MT的ELISA檢測方法,初步研制了相應的試劑盒,為貝類Cd-MT的檢測提供一種快速、靈敏、簡便的檢測方法。主要內(nèi)容如下:
　　 1.企鵝珍珠貝Cd-MT的誘導、提純及鑒定:用不同濃度的CdCl2誘導企鵝珍珠貝合成Cd-MT,結(jié)果表明,企鵝珍珠貝體內(nèi)的Cd-MT含量隨著CdCl2脅迫濃度的增大而增加；采用Sephadex G-50凝膠過濾層析和DEAE-Sepharose Fast Flow離子

4、交換層析對Cd—MT進行分離純化,SDS-PAGE顯示,純化后的Cd-MT及其二聚體分子量分別為9kDa和18kDa；每個Cd-MT分子含有約19.2個巰基；脫金屬后Cd-MT在254nm處的特征峰吸收消失,且吸光度值降低。
　　 2.兔抗企鵝珍珠貝Cd-MT多克隆抗體的制備、提純與鑒定:將Cd-MT與BSA偶聯(lián),SDS-PAGE顯示偶聯(lián)物的分子量大于70kD；用此偶聯(lián)物對家兔進行免疫,獲得效價達1:12800的抗血清；依次用飽

5、和硫酸銨沉淀法和DEAE-Sephadex A50柱層析對抗體進行分離純化,獲得分子量為35kDa的電泳純多克隆抗體；該抗體與企鵝珍珠貝、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)、翡翠貽貝(Perna viridis)、扇貝(Chlamysfarreri)、牡蠣(Crassostrea rivularis)Cd-M工具有較好的交叉免疫反應。
　　 3.企鵝珍珠貝Cd-MT間接非競爭ELISA檢測方法的建立:通過優(yōu)化,確

6、定檢測企鵝珍珠貝Cd-MT的間接非競爭ELISA法的最佳反應條件為:以生理鹽水為包被液,于37℃包被2h:用2％的脫脂奶粉于37℃封閉30min；Cd—MT抗體最適濃度為25μg/mL,抗原與抗體作用時間為1h；酶標二抗的最適稀釋度為1:4000,一抗與二抗作用時間為1h；顯色時間為10min。在Cd-MT濃度為9.75～2×104ng/mL范圍內(nèi),方法的回歸方程y=0.1336Lnx+0.9693,R2=0.991,檢出限為(4.56

7、3±0.051)ng/mL；批內(nèi)相對標準偏差≤11.6％,批間相對標準偏差≤6.7％,回收率在83.7％～119.0％之間；用該方法對企鵝珍珠貝各組織器官MT粗提液中Cd—MT含量進行檢測,得全臟器、鰓、閉殼肌、外套膜、內(nèi)臟團MT粗提液中的Cd—MT含量依次為15.21、8.76、38.74、11.17、76.04ng/g,與各組織器官MT粗提液中的鎘含量呈正相關(guān)。
　　 4.企鵝珍珠貝Cd—MT間接競爭ELISA法的建立及試劑

8、盒的初步研究:建立了間接競爭ELISA方法,并在此基礎(chǔ)上初步研制了檢測企鵝珍珠貝Cd-MT的試劑盒。精密度和準確度實驗表明:該方法的批內(nèi)相對偏差≤8.7％,批間相對偏差≤5.2％,回收率在84.4％～132.8％之間,具有較好的穩(wěn)定性和精確性。在Cd-MT濃度為3.9～2.0×103ng/mL的線性范圍內(nèi),檢出限為1.582ng/mL,抑制中點IC50為405.983ng/mL。保藏實驗表明,該試劑盒在37℃下能保存7天,4℃可保存兩個