摻鍶絲素蛋白納米纖維材料的研制及其用于膜引導(dǎo)骨再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著種植牙技術(shù)的普及及相關(guān)材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，種植牙已成為缺牙修復(fù)的首選方式。然而，重建缺牙區(qū)域的牙槽骨組織，提高種植修復(fù)的長(zhǎng)期成功率和美觀效果，仍然是臨床治療中亟待解決的難題。
　　引導(dǎo)骨再生技術(shù)是解決這一難題最常用、最有效的方法之一，該技術(shù)的關(guān)鍵在于通過(guò)使用屏障膜物理性地阻隔軟組織與骨缺損區(qū)域，給骨缺損區(qū)域創(chuàng)建一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的骨再生空間，保護(hù)生長(zhǎng)且遷移速度較慢的前體成骨細(xì)胞進(jìn)入骨缺損區(qū)，達(dá)到缺損區(qū)骨質(zhì)的修復(fù)性再生。膠原膜是一

2、種最為常見(jiàn)的生物屏障膜材料，然而良好的生物相容性并不能彌補(bǔ)其力學(xué)性能低、骨誘導(dǎo)能力不足等缺陷。絲素蛋白作為一種新型的生物醫(yī)用材料，具有良好的生物相容性、優(yōu)異的力學(xué)性能以及可控的降解性和可塑性，已被廣泛用于骨組織工程領(lǐng)域的研究。近年來(lái)，鍶作為一種新型的骨誘導(dǎo)元素，被證實(shí)對(duì)骨代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用，有利于骨組織的修復(fù)再生。
　　本研究中，我們以絲素蛋白材料為主體，采用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建含鍶元素的仿生絲素蛋白生物膜，系統(tǒng)地對(duì)材料的理化特性進(jìn)

3、行表征，研究材料對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖及成骨向分化的影響，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證材料用于膜引導(dǎo)骨再生的可行性，為新型引導(dǎo)骨再生生物膜的優(yōu)化及開(kāi)發(fā)提供參考。
　　第一部分 改良絲素蛋白納米纖維膜的制備及其用于修復(fù)大鼠顱骨缺損的效果評(píng)價(jià)
　　目的:
　　研究采用新型酸鹽溶解體系及靜電紡絲技術(shù)制備的改良純絲素蛋白膜的理化特性，并將其用于大鼠顱骨缺損的修復(fù)治療，探討將這種絲素蛋白膜代替引導(dǎo)骨再生膜的可行性。
　

4、　方法:
　　1.本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，使用新型的溴化鋰-甲酸溶解體系溶解蠶絲，利于靜電紡絲技術(shù)制備絲素蛋白納米纖維膜。
　　2.利于掃描電子纖維鏡觀察材料的形貌特征，紅外光譜儀分析材料的結(jié)構(gòu)成分，萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)試材料的力學(xué)性能。
　　3.將絲素蛋白納米纖維膜與Bio-gide(R)膠原膜分別植入大鼠顱骨缺損模型，采用Micro-CT檢測(cè)、H&E染色及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色評(píng)估術(shù)后4周與12周時(shí)的骨缺損修復(fù)情況

5、。
　　結(jié)果:
　　1.絲素蛋白膜由隨機(jī)取向的納米纖維組成，纖維直徑為200-600納米，該絲素蛋白膜的力學(xué)性能要優(yōu)于膠原膜。
　　2.大鼠顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:術(shù)后4周時(shí)，絲素蛋白膜的引導(dǎo)骨再生效果優(yōu)于膠原膜;術(shù)后12周時(shí)，兩組骨修復(fù)均已接近完成。
　　結(jié)論:
　　在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們使用靜電紡絲技術(shù)配合新型的蠶絲溶解體系，成功制備了具有良好力學(xué)性能的絲素蛋白納米纖維膜，該膜具有良好的生物相容性、一定

6、的骨引導(dǎo)再生能力及與骨再生相適應(yīng)的降解速率，同時(shí)絲素蛋白材料來(lái)源廣泛、價(jià)格適中，可以作為制備引導(dǎo)骨再生膜的潛在替代材料。
　　第二部分 氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜的制備及其用于膜引導(dǎo)骨再生的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，嘗試將骨誘導(dǎo)元素鍶引入絲素蛋白納米纖維膜中，制備氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜，表征膜材料的理化性能，研究其對(duì)于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其用于引導(dǎo)骨再生膜的

7、可行性。
　　方法:
　　1.在對(duì)絲素蛋白溶液進(jìn)行靜電紡絲的過(guò)程中加入氯化鍶溶液，制成氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜。
　　2.掃描電子顯微鏡觀察材料的形貌特征，X射線衍射儀及X射線光電子能譜儀分析材料的結(jié)構(gòu)組成，浸提實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料中鍶離子的釋放曲線。
　　3.體外大鼠全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分子表型及成骨、成脂向分化鑒定。
　　4.將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與材料共培養(yǎng)，通過(guò)掃描電鏡觀察及CCK-

8、8檢測(cè)細(xì)胞的增殖、粘附情況。
　　5.對(duì)與材料共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過(guò)堿性磷酸酶活性檢測(cè)細(xì)胞的骨向分化。
　　6.將氯化鍶/絲素蛋白膜材料植入大鼠顱骨缺損模型，并與純絲素膜及空白組作對(duì)照研究，采用Micro-CT檢測(cè)、H&E染色及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色評(píng)估術(shù)后6周時(shí)的骨缺損修復(fù)情況。
　　結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)制得含氯化鍶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、5％、10％的氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜,膜材料的外觀與純絲素蛋白膜

9、無(wú)明顯差異，納米纖維直徑隨氯化鍶含量的增加而增大，三組材料在早期均有鍶離子的快速釋放。
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在氯化鍶/絲素蛋白膜表面粘附數(shù)量明顯增多，細(xì)胞增殖活性及堿性磷酸酶活性也高于純絲素蛋白膜組，并且具有一定的濃度依賴性。
　　3.選取10％氯化鍶/絲素蛋白膜用于大鼠顱骨缺損模型的修復(fù)治療，結(jié)果顯示該膜具有更理想的引導(dǎo)骨再生效果。
　　結(jié)論:
　　在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們首次制備了氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜，

10、該新型膜材料具有良好的生物相容性，一定的鍶離子緩釋作用，更優(yōu)異的骨誘導(dǎo)再生能力及與骨再生相適應(yīng)的降解速率?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為這種氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜是一種理想的引導(dǎo)骨再生膜替代材料。
　　第三部分 基于生物礦化的碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜的構(gòu)建及其對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響
　　目的:
　　在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們以絲素蛋白生物大分子為模板，嘗試通過(guò)生物礦化的方法將氯化鍶/絲素蛋白納米纖維中的氯

11、化鍶轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀偷奶妓徭J，以期改善氯化鍶/絲素蛋白膜早期的“爆釋”現(xiàn)象，獲得碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜，袁征材料的形貌特征、碳酸鍶結(jié)晶形態(tài)及鍶離子的釋放量，并進(jìn)一步分析其對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響。
　　方法:
　　1.在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取10％氯化鍶/絲素蛋白納米纖維膜為原料，通過(guò)氣相擴(kuò)散生物礦化的方法制備成碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜
　　2.掃描電子顯微鏡觀察材料的形貌特征，X射線衍射儀分

12、析材料的組成結(jié)構(gòu)，浸提實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料中鍶離子的釋放曲線。
　　3.將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與材料共培養(yǎng)，通過(guò)掃描電鏡觀察及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖、粘附情況。
　　4.對(duì)與材料共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，檢測(cè)堿性磷酸酶活性，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞成骨向分化相關(guān)基因RUNX2、BSP、OCN的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)制得碳酸鍶/絲素蛋白納米纖維膜，膜外觀較礦化前粗糙，平整度稍差。電鏡顯示材料

13、納米纖維表面出現(xiàn)許多納米碳酸鍶顆粒，分布均勻。該材料中鍶離子的釋放量及釋放速率較氯化鍶/絲素蛋白膜明顯降低。
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在碳酸鍶/絲素蛋白表面能形成良好的早期粘附，并不斷增值，細(xì)胞表面早期即分泌出現(xiàn)顆粒樣細(xì)胞外基質(zhì)。
　　3.相較于純絲素蛋白膜，摻鍶的絲素蛋白膜能明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，同時(shí)上調(diào)成骨向分化基因的表達(dá);并且碳酸鍶/絲素蛋白材料的促成骨向分化作用更為明顯。
　　結(jié)論: