酶比活導(dǎo)向的新型高效安培酶電極研究.pdf

1、酶是生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的高效高特異性生物催化劑，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著無(wú)可替代的重要作用。酶?jìng)鞲衅饕悦笧榉肿幼R(shí)別元件，具有選擇性好和靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)。自Clark和Lyons于1962年首次提出酶?jìng)鞲衅饕詠?lái)，隨著生物、化學(xué)、物理學(xué)、醫(yī)學(xué)和電子技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，酶?jìng)鞲衅鲬{借其具有其它生物傳感器所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展成為分析化學(xué)學(xué)科中最為活躍的研究領(lǐng)域之一。顯然，對(duì)固定化酶進(jìn)行酶活性分析和檢測(cè)是評(píng)估酶固定方法優(yōu)劣、優(yōu)化酶固定材料和構(gòu)建

2、新型高效酶生物傳感器的重要手段和主要依據(jù)。本學(xué)位論文中，我們簡(jiǎn)要綜述了壓電傳感技術(shù)、安培酶電極和酶活性分析的近期進(jìn)展，基于固定化酶生物活性測(cè)試和酶固定材料和方法的優(yōu)化開(kāi)展了以下研究工作：
　　 (1)考察了電化學(xué)或化學(xué)預(yù)氧化兒茶酚胺(CA)在普魯士藍(lán)(PB)修飾電極上的電聚合，籍此高效包埋固定葡萄糖氧化酶(GOx)、實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的靈敏安培生物傳感。所涉及的CA包括多巴胺(DA)、L-去甲腎上腺素(NA)和腎上腺素(EP)，詳細(xì)

3、研究了以DA為單體的預(yù)氧化-電聚合固定酶法所構(gòu)建的傳感器的性能。利用電化學(xué)石英晶體微天平(EQCM)監(jiān)測(cè)了電極修飾過(guò)程，并對(duì)幾種化學(xué)預(yù)氧化劑和陽(yáng)極電化學(xué)預(yù)氧化電位進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。與常規(guī)電聚合法相比，預(yù)氧化步驟明顯提高了所得傳感器性能。在優(yōu)化條件下所得傳感器對(duì)葡萄糖的檢測(cè)下限(LOD)為0.30μM，靈敏度為35μAmM-1 cm-2，穩(wěn)定性和抗干擾性好，且在-0.05 V檢測(cè)電位下亦有優(yōu)良分析性能。紫外可見(jiàn)光譜法和EQCM法檢測(cè)結(jié)果證

4、實(shí)所固定的GOx酶比活性(ESA)高，基于NA聚合物的酶膜性能與DA聚合膜的基本相當(dāng)，但EP聚合低效且其酶膜的生物傳感性能差。
　　 (2)K3Fe(CN)6快速化學(xué)氧化DA和NA產(chǎn)生相應(yīng)的化學(xué)氧化聚合物(PDAc和PNAc)并同時(shí)有效包埋GOx。將該酶-高分子復(fù)合物滴干于金電極表面，并用殼聚糖(CS)進(jìn)一步固定構(gòu)建了高性能生物傳感器和生物燃料電池(BFC)。所得CS/PDAc-GOx/Au酶電極對(duì)葡萄糖靈敏度高(135μA m

5、M-1cm-2)、LOD低(0.07μM)、響應(yīng)時(shí)間短(小于3 s)、抗干擾能力好。而且，該傳感器熱穩(wěn)定性良好，在30℃下使用壽命達(dá)兩個(gè)月，在60℃下壽命為三周。此外，該傳感器在以苯醌(BQ)或二茂鐵甲酸(Fc)為電子媒介體的第二代傳感模式下亦具有良好的分析性能，BQ和Fc的使用極大地拓寬了該傳感器的線性范圍(對(duì)BQ為2.0μM～48.0 mM，對(duì)Fc為2.0μM～16.0mM)并顯著提高了葡萄糖飽和電流密度(高達(dá)8.0 mA cm-2

6、)。利用這些人工電子媒介體在酶膜中良好的滲透性，我們根據(jù)已有動(dòng)力學(xué)模型對(duì)所固定的GOx及其酶活進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明CS/PDAc-GOx/Au電極上實(shí)現(xiàn)了酶的高負(fù)載量、高活性固定。同時(shí)，CS/PDAc-GOx/Au作為生物陽(yáng)極構(gòu)建的BFC最大功率密度達(dá)1.62 mW cm-2，優(yōu)于目前所報(bào)道的大多數(shù)BFC。
　　 (3)結(jié)合DA易吸附易聚合的性質(zhì)和多壁碳納米管(MWCNTs)的高導(dǎo)電性，以GOx為模型酶，在磷酸緩沖液(PBS

7、)中合成DA-MWCNTs-GOx復(fù)合物并通過(guò)過(guò)量DA的電化學(xué)氧化聚合實(shí)現(xiàn)了GOx在石英晶體微天平(QCM)金電極表面的高效固定。結(jié)果表明，導(dǎo)電納米材料MWCNTs的引入改善了DA單體在電極表面的電沉積，實(shí)現(xiàn)了酶的高效包埋。同時(shí)，不導(dǎo)電聚多巴胺膜(PDA)賦予了該傳感器優(yōu)良的抗干擾能力。所制備的PDA-MWCNTs-GOx/Au酶電極對(duì)葡萄糖的檢測(cè)靈敏度高(60±3.2μAmM-1 cm-2)、LOD低(0.20μM)、線性范圍寬且抗干

8、擾能力強(qiáng)。
　　 (4)活性蛋白(如酶)在界面的吸附在科研、工業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛意義。吸附酶的構(gòu)象和取向?qū)@著影響吸附酶性能。因此，通過(guò)控制吸附條件實(shí)現(xiàn)對(duì)吸附酶性能的有效調(diào)控在眾多領(lǐng)域都具有重要應(yīng)用價(jià)值。本章采用EQCM和紫外可見(jiàn)光譜法研究了GOx在裸金電極和多種短鏈巰基化合物(R-CH2-SH，R=-CH3，-CH2OH，-COOH或-CH2NH2)修飾金電極上的吸附，同時(shí)對(duì)所得吸附酶的酶活性及酶與電極間的直接電子傳遞進(jìn)行

9、了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)增大吸附液中離子強(qiáng)度和適當(dāng)降低酶濃度能顯著改善吸附酶的活性。優(yōu)化條件下，在電極表面可吸附固定同時(shí)具有高酶活性和高電活性的酶。
　　 (5)重金屬(HM)離子與酶的相互作用是許多領(lǐng)域的重要研究課題。本章以GOx為例，提出了一種基于QCM和電化學(xué)分析技術(shù)的綜合實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，用于研究HM離子與酶的相互作用并對(duì)HM離子進(jìn)行了安培抑制分析。通過(guò)陽(yáng)極安培檢測(cè)酶生H2O2，研究了HM離子對(duì)溶液態(tài)GOx(GOxs)、吸附態(tài)G

10、Ox(GOxads)和聚合物包埋的GOx(GOxe)的酶活性的抑制效果。在所考察的多HM離子中，Ag+對(duì)GOxs、GOxads和NA聚合膜(PNA)包埋的GOxe(GOxe-PNA)表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制效果，檢測(cè)下限分別為2.0、8.0和5.0nM。Hg2+、Cu2+和Co2+均需達(dá)到15μM以上濃度才開(kāi)始抑制GOx活性，且濃度高達(dá)1.0 mM的Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+和As3+對(duì)GOx活性亦無(wú)明

11、顯抑制作用。基于該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，我們檢測(cè)并首次報(bào)道了GOxads酶活的抑制百分率與一個(gè)GOxads分子上結(jié)合多少個(gè)HM離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系。此外，與其它幾種用于酶包埋和酶抑制分析的聚合物相比，PNA對(duì)HM離子親和力小，且對(duì)Ag+抑制分析具有最高靈敏度和最小干擾。該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)有望很好地用于很多氧化還原事件相關(guān)酶的抑制分析及其HM離子抑制效應(yīng)的定量研究。
　　 (6)利用有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)的選擇性抑制，進(jìn)行有機(jī)磷的快速高敏檢測(cè)

12、頗具意義。本章中，我們提出了一種利用溶液態(tài)AChE(AChEs)和吸附態(tài)AChE(AChEads)快速檢測(cè)對(duì)氧磷(PO)的新方法，并結(jié)合QCM與電化學(xué)方法對(duì)AChE酶活性進(jìn)行了定量測(cè)試?？疾炝宋揭褐须x子強(qiáng)度和酶濃度對(duì)底物硫代乙酰膽堿及抑制劑PO在所得AChEads/Au電極上響應(yīng)靈敏度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明吸附液中高離子強(qiáng)度和較低的酶濃度更有利于得到對(duì)底物及對(duì)抑制劑同時(shí)具有靈敏響應(yīng)的AChEads。在優(yōu)化條件下，AChEs和AChEad