新型腫瘤靶向超小超順磁氧化鐵納米粒在動物體內(nèi)的評價.pdf

1、目的
　　 1.以葡聚糖-超順磁氧化鐵納米粒(dextran—superparamagnetic iron oxidenanoparticles,dextran-SPIO-NPs)為陽性對照,對本課題組已經(jīng)制備好的羧甲基殼聚糖-超小超順磁氧化鐵納米粒(o—carboxymethyl chitosans ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide nanoparticles,OCMCS—USPIO

2、-NPs)和葉酸-羧甲基殼聚糖-超小超順磁氧化鐵納米粒(Folic acid—o-carboxymethyl chitosans ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide nanoparticles,FA-OCMCS—USPIO-NPs)進行小鼠急性毒性方面的研究。
　　 2.以dextran-SPIO-NPs為陽性對照,采用紫外-可見分光光度法考察FA—OCMCS-USPIO-NPs和OCM

3、CS—USPIO-NPs在大鼠體內(nèi)的藥物代動力學特征。
　　 3.以dextran-SPIO-NPs為陽性對照,考察FA-OCMCS-USPIO-NPs和OCMCS-USPIO-NPs在小鼠體內(nèi)的組織分布學特征時設計了兩組試驗:紫外-可見分光光度法測定組織內(nèi)的鐵含量和核磁共振成像法在體考察藥物分布。
　　 4.采用核磁共振成像技術分別評價了FA-OCMCS—USPIO-NPs對BACB/C-nu裸鼠KB細胞移植瘤和OCM

4、CS-USPIO-NPs對新西蘭兔VX2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的造影效果。
　　 方法
　　 1.急性毒性的評價簡單介紹了陽性對照dextran-SPIO-NPs和試驗藥OCMCS-USPIO-NPs與FA-OCMCS-USPIO-NPs的合成方法,主要對兩種試驗藥的急性毒性進行考察。dextran-SPIO-NPs的合成采用堿性共沉淀法:在葡聚糖溶液中合成SPIO-NPs的同時對納米粒進行包被。分兩步合成OCMCS-USPIO-

5、NPs:先采用堿性共沉淀法合成SPIO-NPs核心,再在SPIO-NPs表面嫁接OCMCS。在合成好的OCMCS-USPIO-NPs表面再嫁接以葉酸就合成出了FA-OCMCS—USPIO-NPs。馬爾文激光粒徑測定儀測定三種納米粒的水合粒徑。急性毒性的考察選擇KM小鼠為實驗對象,分別尾靜脈一次性給予小鼠三個濃度(278,347.5和434.5mgFe·kg-1)的三種納米粒,觀察14d內(nèi)小鼠的死亡、飲食和體重變化情況。
　　 2

6、.藥代動力學評價SD大鼠禁食12h后(自由飲水),尾靜脈一次給予1mL生理鹽水及5.87和13.27 mgFe·kg-1的三種納米粒,并于給藥后的0.25,0.5,1,2,4,6,8,12,24h從眼底靜脈叢采血0.5mL,至于肝素鈉化的EP管中,5000r·min-1離心10min,取0.2mL上清液測定鐵含量。由于三種納米粒的活性成分是鐵,故采用鄰二氮菲法測定血漿內(nèi)的鐵含量。用移液器精密量取血漿樣品0.2mL于西林瓶中,加入1mL硝

7、酸-高氯酸(3:1,v:v),室溫下消化24h后用平板加熱器蒸干,待冷卻后加入3％的鹽酸溶液1mL溶解西林瓶中的Fe3+離子,并轉(zhuǎn)入10mL容量瓶,分別依次加入10％的鹽酸羥胺溶液1mL、0.15％的鄰二氮菲溶液2mL、1 mol·L-1 NaAc溶液5 mL,蒸餾水標定,于最大吸收波長處測定吸光度,帶入標準曲線方程求出鐵含量,再按照稀釋比例求算血漿內(nèi)的鐵含量。
　　 3.組織分布學考察
　　 3.1.組織鐵含量測定采用

8、鄰二氮菲法測定組織內(nèi)的鐵含量。用分析天平稱取50mg各組織于西林瓶中,加入1mL混酸(硝酸-高氯酸體積比3:1),室溫下消化24h后用平板加熱器蒸干,待冷卻后加入3％的鹽酸溶液1mL溶解西林瓶中的Fe3+離子,并轉(zhuǎn)入10mL容量瓶,分別依次加入10％的鹽酸羥胺溶液1mL、0.15％的鄰二氮菲溶液2mL、1 mol·L-1 NaAc溶液5 mL,蒸餾水標定,以紫外-可見分光光度法于最大吸收波長處測定吸光度,帶入標準曲線方程求出鐵含量,再按

9、照稀釋比例求算血漿內(nèi)的鐵含量。
　　 KM小鼠禁食12h后(自由飲水),空白對照組尾靜脈一次給予0.2mL生理鹽水,給藥組分別從尾靜脈一次給予9.53mg·kg-1或19.06mg·kg-1的三種納米粒后,分別于2,4,8,16h處死動物(每個時間點3只),取心、肝、脾、肺、腎。用生理鹽水洗凈組織上的殘血,濾紙吸干水分后準確稱取50mg,測定各時間點的組織鐵含量。
　　 取空白組和16h時高濃度三給藥組小鼠的心、肝、脾、

10、肺、腎,于10％福爾馬林溶液中固定24h,石蠟包埋并切片,普魯士藍染色后,于光學顯微鏡觀察并拍照。
　　 3.2.磁共振考察在體分布SD大鼠禁食12h后(自由飲水),用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉。先平掃所有動物,之后所有動物尾靜脈一次給予28μg·kg-1的dextran-SPIO-NPs,OCMCS-USPIO-NPs或FA-OCMCS-USPIO-NPs,分別在給藥后的1,2,4,6,8,24h進行磁共振掃描。采用頭部線圈

11、行T2冠狀面掃描,掃描序列參數(shù)如下:采用自旋回波-T2加權像(SE-T2WI)掃描序列,重復時間(TR)和回波時間(TE)分別是4000ms和106ms,視野(field of view,FOV):12×12cm,層厚2mm。使用Image Viewer軟件測定肝、肺、腎的T2信號值(SI),在背景區(qū)域選取較大的區(qū)域測定背景噪聲的標準差(Standard deviation of the noise,SD),求出各組織各時間點的信噪比(

12、signal to noise ratio,SNR),計算公式為:SNR=SI/SD,比較給藥前和給藥后各時間點三種臟器SNR的變化情況。
　　 4.藥效學評價荷KB瘤裸鼠采用頭部線圈行T2冠狀面掃描,掃描序列參數(shù)如下:采用自旋回波-T2加權像(SE-T2WI)掃描序列,重復時間(TR)和回波時間(TE)分別是4000ms和85ms,視野(field of view,FOV):12×12cm,層厚3mm。腹腔注射4％的水合氯醛溶

13、液麻醉后平掃所有動物,尾靜脈給予5.62 mg·ml-1的FA-OCMCS-SPIO-NPs溶液0.25ml,3h后進行MRI掃描。
　　 VX2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移新西蘭兔采用頭部線圈行T2冠狀面掃描,掃描序列參數(shù)如下:采用快速自旋回波-T2加權像(FSE-T2WI)掃描序列,重復時間(TR)和回波時間(TE)分別是3500ms和85ms,視野(field of view,FOV):10×10cm,層厚3mm。采用3％的戊巴比妥鈉(4℃

14、保存)溶液耳緣靜脈注射麻醉后平掃所有動物,耳緣靜脈給予2.00mg·ml-1的OCMCS-SPIO-NPs溶液16.80ml,給藥12h后再進行MRI掃描。
　　 裸鼠腫瘤和新西蘭兔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的造影效果分別用信噪比(signal to noiseratio,SNR)和對比噪聲比(contrast to noise ratio,CNR)進行評價。采用MRI閱片軟件CDViewer對兩組實驗動物給藥前、后感興趣區(qū)(Region of

15、 interest,ROI)的信號強度(signal intense,SI)進行測量,ROI選擇局部信號相對均勻,無明顯偽影的區(qū)域測量三次,取SI平均值。裸鼠給藥前、后腫瘤的SNR計算見3.2方法項下,兔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移給藥前、后CNR計算公式為:CNR=| SInormal—SIcancer|/SDbackground。SInormal,SIcancer和SDbackground分別是淋巴結(jié)正常組織信號,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織信號和背景噪聲的標準差

16、。
　　 分別做裸鼠KB腫瘤和兔VX2腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的HE染色切片,判斷成瘤和轉(zhuǎn)移情況；做給藥前、后KB腫瘤和兔VX2腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的普魯士藍染色切片,判斷FA-OCMCS-SPIO-NPs對KB腫瘤的靶向性和OCMCS-SPIO-NPs對兔VX2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的造影效果。
　　 結(jié)果
　　 1.dextran-SPIO-NPs,OCMCS-USPIO-NPs和FA-OCMCS—USPIO-NPs的水合粒徑

17、分別為125nm,38.2nm和41.4nm。急性毒性結(jié)果表明FA-OCMCS-USPIO-NPs和OCMCS-USPIO-NPs的LD50均大于434.5 mgFe·kg-1,小于陽性對照藥dextran-SPIO-NPs的LD50(大于347.5 mgFe·kg-1)。兩試驗藥物組中所有動物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應；dextran-SPIO-NPs組中從中等劑量組開始生存動物出現(xiàn)明顯毒性反應。
　　 2.由于藥代動力學實驗中,

18、基礎血漿鐵濃度隨時間的變化而波動(1h時出現(xiàn)突釋峰,之后緩慢下降,4h以后在5mg·L-1左右波動,24h時恢復初始水平),所以,血漿中三種納米粒的濃度分別以給藥后血漿鐵濃度減去空白血漿鐵濃度表示。結(jié)果表明,粒徑更小的兩試驗藥在體內(nèi)半衰期(t1/2)更長(大于7小時),藥時曲線下面積更大,體內(nèi)滯留時間(MRT)顯著性延長。
　　 3.五種臟器的鐵含量測定結(jié)果顯示,三種造影劑主要分布于肝、脾部位,但較之于dextran-SPIO-

19、NPs,不論給予低濃度還是高濃度的藥物,肝、脾對FA-OCMCS—USPIO-NPs和OCMCS-USPIO-NPs的吞噬量明顯減少,并且FA-OCMCS-USPIO-NPs的吞噬也明顯少于OCMCS-USPIO-NPs,這可能是因為嫁接葉酸以后納米粒具有了靶向性,更多的集中于靶組織中,亦或是參與了葉酸途徑的代謝,降低了肝、脾途徑代謝的量。以上結(jié)論可以從三種藥物各臟器普魯士藍染色切片圖上清楚的看到。
　　 磁共振考察肝、肺和腎的

20、結(jié)果表明,三種臟器的基礎T2信號值不同,由大到小依次為腎>肝>肺。給藥后dextran-SPIO-NPs組肝臟信號下降明顯,說明肝臟吞噬了納米粒,使SNR值降低；同時腎臟SNR值降低明顯,說明粒徑更大的dextran—SPIO-NPs更容易被代謝出體外。肺部以及兩試驗組肝臟各時間點SNR均值幾乎沒有變化。24h時dextran-SPIO-NPs組和FA-OCMCS-USPIO-NPs組的腎臟SNR值恢復至給藥前的水平,但OCMCS-US

21、PIO-NPs組只恢復至給藥后2-4h的水平,說明OCMCS-USPIO-NPs在體內(nèi)保留了更久的時間,24h時還有藥物從體內(nèi)排泄,FA-OCMCS-USPIO-NPs恢復至給藥前水平可能是由于嫁接葉酸以后粒徑有所增加,加快了體內(nèi)代謝的過程。
　　 4.藥效學結(jié)果顯示,尾靜脈給予FA-OCMCS-USPIO-NPs后裸鼠KB腫瘤T2信號明顯降低(FA-OCMCS-USPIO-NPs對有葉酸受體的KB腫瘤有靶向作用),耳緣靜脈給予

22、OCMCS—USPIO-NPs后兔胭窩淋巴結(jié)正常部位T2信號值下降(淋巴結(jié)內(nèi)的巨噬細胞能吞噬OCMCS-USPIO-NPs),而癌變部位T2信號和給藥前一樣,幾乎沒有變化(巨噬細胞失去功能不能再吞噬納米粒)。統(tǒng)計結(jié)果顯示,給藥前、后KB瘤的SNR有顯著性差異(t=11.596,P=0.007),VX2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的CNR有顯著性差異(t=10.586,P=0.009),說明兩造影劑效果明顯。普魯士藍染色切片圖說明KB瘤內(nèi)有FA-OCMC

23、S-USPIO-NPs分布(有藍色顆粒),VX2胭窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的正常組織內(nèi)有OCMCS-USPIO-NPs分布(有藍色顆粒),癌變組織內(nèi)無納米粒(無藍色顆粒)。
　　 結(jié)論
　　 1.急性毒性考察結(jié)果表明FA—OCMCS—USPIO-NPs和OCMCS-USPIO-NPs的急性毒性小于dextran-SPIO-NPs,這可能是試驗藥物的粒徑(小于50nm)遠小于陽性對照藥物(大于100nm)造成的,也可能是因為包被材料O

24、CMCS的生物相容性更優(yōu)于dextran,導致體內(nèi)毒性下降。
　　 2.藥代動力學結(jié)果說明大粒徑的陽性對照dextran-SPIO-NPs進入體內(nèi)后迅速被肝、脾吞噬代謝,體內(nèi)半衰期和AUC較小,而小粒徑的OCMCS-USPIO-NPs和FA-OCMCS—USPIO-NPs部分逃避了肝、脾的吞噬,在血液中維持了較長的時間和較高的濃度,為腫瘤靶向造影提供了依據(jù)。
　　 3.給藥后肝、脾對dextran-SPIO-NPs的吞噬

25、顯著高于FA-OCMCS-USPIO-NPs和OCMCS-USPIO-NPs,說明小粒徑的兩試驗藥部分逃避了肝、脾內(nèi)巨噬細胞的吞噬,為二者能分布到全身其他部位進行造影打下了基礎:磁共振在體研究三種納米粒分布代謝中也證實了肝臟對dextran-SPIO-NPs的吞噬,而同等劑量的兩試驗藥沒有吞噬,三種藥物在肺中沒有分布,均從腎臟排泄出體外。
　　 4.藥效學結(jié)果表明,FA-OCMCS-USPIO-NPs對具有葉酸受體的裸鼠KB細胞