冠突散囊菌分離培養(yǎng)及接種發(fā)酵夏秋茶初步探究.pdf

1、茯磚茶是我國特有的黑茶品類中的一種，具有黑茶獨(dú)特的品質(zhì)與保健功能，是近幾年來的消費(fèi)趨勢。同時(shí)，我國夏秋茶資源存在利用率不高，浪費(fèi)現(xiàn)象嚴(yán)重的問題。為此，本實(shí)驗(yàn)從市售茯磚茶中分離純化出在茯磚茶品質(zhì)形成過程中起關(guān)鍵作用的冠突散囊菌，探究其液體發(fā)酵時(shí)的生理生化特性和對夏秋茶茶湯的影響，并嘗試以夏秋茶為原料得到高品質(zhì)的發(fā)酵茶。主要研究結(jié)果如下:
　　1.從市售茯磚茶中分離純化了冠突散囊菌并對其進(jìn)行鑒定
　　通過平板劃線分離法在查氏培養(yǎng)

2、基中分離得到“金花菌”，再利用三點(diǎn)接種法在馬鈴薯葡萄糖瓊脂中進(jìn)行純化。在培養(yǎng)過程中對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)菌落周邊呈白色或淺黃色，中間部分近于橄欖黃色，相較周邊顏色較深，開始有較小的透明油滴狀產(chǎn)生，后期變?yōu)樽虾谏?，色素逐漸擴(kuò)散于基質(zhì)中。菌株存在無色的菌絲體且沒有分支，黃色的閉囊殼呈球形或近球形，直徑為45-65μm，成熟較快。采用通用引物ITS1和ITS4對分離得到的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約500 bp的片段。在GenBank數(shù)據(jù)

3、庫中使用BLAST軟件對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行同源搜索比對，結(jié)果表明得到的菌株與阿姆斯特丹散囊菌Eurotium amstelodami(GU723274.1)的相似性達(dá)99％。結(jié)合菌落形態(tài)和顯微特征可以確認(rèn)，本實(shí)驗(yàn)分離菌株即為冠突散囊菌。
　　2.冠突散囊菌液體發(fā)酵的最佳條件及其理化成分的動(dòng)態(tài)變化
　　以CZ培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對冠突散囊菌液體發(fā)酵進(jìn)行單因素探究，得到蔗糖為最佳碳源，磷酸二氫銨為最佳氮源的結(jié)論。另外對碳源及氮源

4、濃度的探究實(shí)驗(yàn)表明采用2％-4％的蔗糖濃度、0.15％-0.2％的磷酸二氫銨濃度配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基最為合適。在最優(yōu)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行冠突散囊菌搖瓶培養(yǎng)，以pH值、接種量和搖瓶轉(zhuǎn)速為自變量，菌絲球干重為響應(yīng)值設(shè)計(jì)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-expert軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明pH值5.55，接種量0.96％，搖瓶轉(zhuǎn)速125.98 r/min為液體發(fā)酵的最佳條件，在此條件下?lián)u瓶108 h可得菌絲球干重0.323 g/

5、100mL。
　　在冠突散囊菌液體發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長冠突散囊菌的菌絲球數(shù)量變多且不斷增大，發(fā)酵液的顏色逐漸變深直至變成棕褐色，步入衰退期后溶液變混濁;發(fā)酵液的pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的增加先逐漸降低，而后又有所回升，在60 h時(shí)pH值達(dá)到最低點(diǎn)4.32;多酚含量、黃酮含量和多糖含量隨著液體發(fā)酵時(shí)間的增加呈下降趨勢，多酚含量由最初的91.56 mg/100mL降到40.01 mg/100mL，且在發(fā)酵前期多酚類物質(zhì)下降較多，黃

6、酮含量的下降趨勢緩慢，多糖含量由最初的28.32 mg/mL降低到14.98 mg/mL;發(fā)酵液中的氨基酸總量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長先下降后上升，于84 h達(dá)到最低值4.55 mg/100mL。
　　3.實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下利用冠突散囊菌人工發(fā)酵夏秋茶及發(fā)酵對茶葉品質(zhì)的影響
　　在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，以外加水量、殺菌強(qiáng)度、發(fā)酵種子液加入量、封裝方式作為四個(gè)實(shí)驗(yàn)因子設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)對冠突散囊菌的發(fā)酵條件進(jìn)行探究，結(jié)果表明利用冠突散囊菌人

7、工發(fā)酵茶葉的最佳條件為外加水量:10％、殺菌強(qiáng)度:560 w，60 s、接種量:5％、封裝方式:完全開口。采用上述條件發(fā)酵得到的茶葉最受志愿者的歡迎。
　　對最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵所得茶葉的常規(guī)成分進(jìn)行測定，并與夏秋茶、市售湖南茯磚茶和江蘇黑茶進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種茶樣的含水量、兒茶素含量和蛋白含量沒有顯著性差異。與夏秋茶相比，發(fā)酵茶的水浸出物含量顯著上升，而多糖含量、茶多酚含量和游離氨基酸含量顯著下降。經(jīng)過發(fā)酵，茶葉中所有酚酸的含量

8、都發(fā)生變化，且與夏秋茶都存在顯著性差異。其中沒食子酸和阿魏酸的含量有所降低;4-羥基苯甲酸和(+)-兒茶素的含量大幅降低;咖啡酸的含量有所上升。發(fā)酵后，(+)-兒茶素和阿魏酸的含量與江蘇黑茶更接近，沒有顯著性差異。為了進(jìn)一步探究發(fā)酵對茶葉的影響，以清除ABTS自由基能力、清除羥基自由基能力和金屬螯合能力為衡量指標(biāo)測定了幾種茶樣的抗氧化能力，結(jié)果表明夏秋茶經(jīng)發(fā)酵后，其清除ABTS自由基的能力、清除羥基自由基的能力顯著降低，金屬螯合能力也有