別藻藍(lán)蛋白的生物合成及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、別藻藍(lán)蛋白是藻膽蛋白中的一種，主要存在于藍(lán)藻和紅藻中，是一種輔助色素蛋白，在生物體中主要擔(dān)任能量傳遞與部分能量貯存的功能，具有熒光特性。別藻藍(lán)蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景，它除了可用于食品、化妝品等領(lǐng)域外，還可將其制成熒光試劑，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得以應(yīng)用。
　　目前別藻藍(lán)蛋白獲取的主要途徑為從藻體中提取。別藻藍(lán)蛋白的獲取需經(jīng)過藻種培育、提取純化等過程，獲取周期長、分離純化困難、制備成本高，這很大程度上限制了它的應(yīng)用，成為別藻藍(lán)蛋白熒光探針

2、試劑化、商業(yè)化的主要限制因素。為了更加快速、簡捷地獲取別藻藍(lán)蛋白，分子生物學(xué)方法過程簡單、提取純化方便、制備成本低，成為現(xiàn)階段熱門的制備研究方法。但通過生物學(xué)基因克隆手段獲得的重組別藻藍(lán)蛋白熒光穩(wěn)定性差，在受熱、pH值變化以及長時(shí)間放置的情況下容易變性，直接限制了它在熒光試劑方面的應(yīng)用。
　　本試驗(yàn)首先對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，利用響應(yīng)面法優(yōu)化別藻藍(lán)蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的重組表達(dá)條件，最后獲得的最佳發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)溫度28℃

3、、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH8.5、誘導(dǎo)時(shí)間3 h、IPTG終濃度0.1 mM，利用該條件發(fā)酵得到的重組別藻藍(lán)蛋白含量與優(yōu)化前本試驗(yàn)原始誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的結(jié)果(即表達(dá)量9 mg/L)相比較，蛋白表達(dá)量增加為原來的2.3倍(即表達(dá)量20.4 mg/L),與文獻(xiàn)報(bào)道的重組別藻藍(lán)蛋白α亞基蛋白表達(dá)量3-12 mg/L[54]相比較，表達(dá)量提高了70％-580%。
　　在發(fā)酵結(jié)果高效穩(wěn)定的前提下，對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性從分子水平和結(jié)構(gòu)水平兩方面入手

4、展開試驗(yàn)研究分析。在其分子水平分析中，通過比對(duì)兩種不同藻種集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)和嗜熱藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)別藻藍(lán)蛋白β亞基的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了14個(gè)位點(diǎn)的氨基酸不同（我們將其定義為差異位點(diǎn)），通過定點(diǎn)突變、發(fā)酵表達(dá)及熱穩(wěn)定性分析等一系列試驗(yàn)，最后獲得了11個(gè)位點(diǎn)的14個(gè)定點(diǎn)突變體（其中包括11個(gè)但位點(diǎn)突變體和3個(gè)雙位點(diǎn)突變體），并證明這11個(gè)位點(diǎn)

5、與別藻藍(lán)蛋白熱穩(wěn)定性存在很大關(guān)聯(lián)，猜測其參與了別藻藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性調(diào)控。
　　在其結(jié)構(gòu)水平分析中，通過追蹤重組別藻藍(lán)蛋白合成的整個(gè)生物反應(yīng)過程，對(duì)過程中與重組別藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性相關(guān)的因素進(jìn)行試驗(yàn)分析。試驗(yàn)比較了不同裂合酶的催化效果，發(fā)現(xiàn)不同裂合酶對(duì)色基與脫輔基蛋白的催化結(jié)合作用存在明顯差異；同時(shí)通過基因工程手段表達(dá)獲得色基、裂合酶和脫輔基蛋白的單一物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了重組別藻藍(lán)蛋白色基與脫輔基蛋白的體外催化合成及重組別藻藍(lán)蛋白三聚體的體外

6、自組裝，摸索了重組別藻藍(lán)蛋白的體外催化合成及自組裝試驗(yàn)條件，通過體外催化合成試驗(yàn)獲得的重組別藻藍(lán)蛋白(APC-α, APC-β)色基結(jié)合率分別由原來的28.6%和14.3%提高至90%左右，分別為原色基結(jié)合率的3倍和6倍，色基結(jié)合率提高效果顯著；試驗(yàn)分別通過藻體提取、直接表達(dá)獲取以及表達(dá)后進(jìn)一步體外催化組裝方法獲得三種色基結(jié)合率不同的別藻藍(lán)蛋白三聚體（即色基結(jié)合率：天然APC＞組裝APC＞表達(dá)APC），對(duì)三種別藻藍(lán)蛋白三聚體進(jìn)行溫度及p