基于超電荷綠色熒光蛋白與納米材料的傳感及納米材料毒性研究.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)是生物體自身編碼表達的一種蛋白，在生物學、醫(yī)學等領(lǐng)域有廣泛的研究及應(yīng)用。新近發(fā)現(xiàn)的GFP突變體，超電荷綠色熒光蛋白(scGFP)，具有高抗鹽性、pH穩(wěn)定性、可以作為核酸載體等性質(zhì)。目前關(guān)于scGFP與納米材料的相互作用及其在生物傳感上的應(yīng)用還未見報道。與納米技術(shù)的快速發(fā)展相比，納米材料毒性研究還處于初級階段，相關(guān)毒性機理需要深入探討。
　　本文詳細研究了scGFP與氧化石墨烯(GO)的相互作用，基于此開發(fā)了一

2、種無標記熒光傳感器用于肌紅蛋白檢測。另外，利用全細胞傳感器研究了表面形貌對納米銅毒性的影響。具體工作如下:
　　1、首次研究了scGFP與GO的相互作用，并且探討了DNA對scGFP/GO相互作用的影響。通過原子力顯微鏡、熒光偏振、圓二色譜等表征手段，發(fā)現(xiàn)seGFP除了通過π-π;堆積作用與GO結(jié)合，還能夠通過靜電作用吸附在GO表面，使單層GO聚集成多層GO，形成scGFP/GO復合物。該seGFP/GO復合物中，scGFP與GO

3、足夠靠近，發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，scGFP熒光被GO猝滅。當引入DNA時，DNA會與scGFP結(jié)合，并且拉近scGFP之間的距離使scGFP聚集成較大的顆粒。再加入GO時，聚集的scGFP大顆粒只能吸附在帶有羥基和羧基基團的GO的邊緣，GO不會聚集。大顆粒的空間位阻使其中大部分scGFP與GO遠離，熒光保留。
　　2、利用新近篩選的肌紅蛋白核酸適體(MA)，構(gòu)建了一種基于GO/scGFP相互作用的核酸傳感器用于無標記檢測肌紅蛋白。

4、scGFP與GO相互作用時能夠猝滅scGFP的熒光;當有肌紅蛋白核酸適體MA存在時，scGFP會與MA結(jié)合發(fā)生團聚，再吸附在GO邊緣，熒光會保留;當有肌紅蛋白存在時，MA特異性地與肌紅蛋白結(jié)合，scGFP就會再次與GO相互作用，熒光猝滅。通過檢測熒光的變化可以定量檢測肌紅蛋白。本方法對肌紅蛋白的檢測獲得了較低的檢測限(0.16μg/mL)和較寬的線性范圍（0.3μg/mL-10μg/mL）。本方法成功運用于實際血清樣品中肌紅蛋白的檢測，

5、且在添加回收實驗中獲得了很好的回收效果，回收率為87.7-107.6％。由于scGFP與GO都有很好的生物相容性，本方法有潛力應(yīng)用在生物樣品的檢測中。如果更換核酸適體，本方法可以用于檢測其他蛋白、癌細胞等，擴展了GO以及scGFP的應(yīng)用范圍。
　　3、利用微生物全細胞傳感器研究了納米銅表面形貌對其毒性的影響。比較了購買的納米銅球形顆粒與合成的八面體籠結(jié)構(gòu)、納米花結(jié)構(gòu)以及小粒子納米銅的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)形貌不同產(chǎn)生的毒性大小也不同。進一