厭氧氨氧化微生物學(xué)研究.pdf

1、針對厭氧氨氧化菌分離困難這一現(xiàn)狀，本課題循著“獲得厭氧氨氧化菌混培物，研究混培物性狀；獲得厭氧氨氧化菌純培物，研究純培物性狀”的技術(shù)路線，對厭氧氨氧化的微生物學(xué)性能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1)以垃圾填埋場滲濾液處理廠污泥(W1)、城市污水處理廠污泥(W2)以及味精廢水處理廠污泥(W3)作為接種物，以經(jīng)處理的味精廢水作為培養(yǎng)液，經(jīng)過400多天的富集，都獲得了顯現(xiàn)厭氧氨氧化活性的富集培養(yǎng)物，表明三種污泥都可作為厭氧氨

2、氧化反應(yīng)器的接種污泥。
　　 以表觀最大厭氧氨氧化速率(Vmax)作為指標(biāo)，W3富集培養(yǎng)物的厭氧氨氧化活性(5.26 mg/L.h)最高，W1富集培養(yǎng)物(4.20 mg/L.h)次之，W2富集培養(yǎng)物(2.83 mg/L.h)最低。以污泥顆粒的大小，菌膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)，污泥的沉降速度以及污泥體積指數(shù)作為指標(biāo)，W3污泥最佳，W2污泥次之，W1污泥最差。以VS/TS作為指標(biāo)，富集前后W1污泥的質(zhì)量基本保持不變；W2污泥和W3污泥的質(zhì)量都明顯

3、提高，其中W3污泥的質(zhì)量提高最多，W2污泥次之，W1污泥最少。從三種接種污泥均可成功定向富集厭氧氨氧化菌，其中以W3污泥富集的厭氧氨氧化菌數(shù)量最多，W1污泥和W2污泥的厭氧氨氧化菌數(shù)量比較接近。富集以后，三種污泥的種群數(shù)量減少，但在DGGE膠上都出現(xiàn)了厭氧氨氧化菌的特異性條帶，其中以W3污泥的條帶最亮，W2污泥次之，W1污泥最弱，表明富集以后W3污泥的厭氧氨氧化菌豐度最高，W2次之，W1最小。
　　 2)以硝化污泥作為接種污泥，

4、用顆粒污泥床反應(yīng)器、固定床生物膜反應(yīng)器和厭氧序批式反應(yīng)器富集厭氧氨氧化菌，都可成功積累厭氧氨氧化菌混培物，完成厭氧氨氧化啟動。其中，厭氧氨氧化序批式生物反應(yīng)器積累厭氧氨氧化混培物最快，啟動時間最短(約30 d)，容積總氮去除負(fù)荷最高(約2047.00 mq/L.d)；固定床生物膜反應(yīng)器積累混培物的速度次之，啟動時間約40 d，容積總氮去除負(fù)荷為2027.27 mg/L.d；顆粒污泥床反應(yīng)器積累混培物的速度最慢，啟動時間最長(約60 d)

5、，容積總氮去除負(fù)荷最低(約1986.9 mq/L.d)。
　　 三種反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)定性存在一定差異。厭氧序批式反應(yīng)器對基質(zhì)濃度持續(xù)變化的耐受能力最弱，生物膜反應(yīng)器次之，顆粒污泥床反應(yīng)器最強(qiáng)。反之，厭氧序批式反應(yīng)器對水力停留時間持續(xù)變化的耐受能力最強(qiáng)，生物膜反應(yīng)器次之，顆粒污泥床反應(yīng)器最弱。在三個反應(yīng)器中，顆粒污泥床對基質(zhì)負(fù)荷持續(xù)變化的敏感性低于水力負(fù)荷持續(xù)變化，操作中應(yīng)注意控制進(jìn)水流量；生物膜反應(yīng)器和厭氧序批式反應(yīng)器能耐受水力負(fù)

6、荷的持續(xù)變化，但對濃度負(fù)荷持續(xù)變化較為敏感，操作中應(yīng)注意控制進(jìn)水濃度。
　　 對于顆粒污泥床反應(yīng)器和生物膜反應(yīng)器，當(dāng)進(jìn)水氨濃度上升至336 mg/L以后，出水NO3--N濃度呈下降趨勢，而對于序批式反應(yīng)器，出水NO3--N濃度波動不大，并保持在較高水平，若以硝酸鹽產(chǎn)量估算厭氧氨氧化菌產(chǎn)量，則表明在進(jìn)水氨氮濃度較高的情況下，序批式反應(yīng)器比污泥床反應(yīng)器和生物膜反應(yīng)器更有利于厭氧氨氧化菌的生長和菌體積累。
　　 3)將硝化污泥

7、接種于厭氧序批式反應(yīng)器中，經(jīng)歷延滯階段、生長階段和穩(wěn)定階段，可形成厭氧氨氧化顆粒污泥。在污泥顆?；^程中，污泥外觀發(fā)生明顯變化，污泥表面孔隙增加，密實(shí)度下降，顏色從土黃色變成鮮艷的橙紅色。污泥理化性狀也有明顯改變：污泥顆粒明顯增大，平均粒徑從1.20 mm增加到3.69mm，平均濕密度從1.04 g/mL增加到1.07 g/mL，平均沉降速度從107.68 m/h增加到118.49 m/h。顆粒污泥的形成使污泥抗水力沖擊的能力明顯增強(qiáng)，

8、隨出水流失的污泥量較少(TSS<0.03 g/L)，表明厭氧氨氧化顆粒污泥的形成使反應(yīng)器內(nèi)持留高濃度污泥成為可能。
　　 在厭氧氨氧化污泥顆?；^程中，污泥的微生物組成從以絲狀菌和球菌為主轉(zhuǎn)變成以不規(guī)則形狀的厭氧氨氧化菌為主。三大菌群計數(shù)結(jié)合PCR-DGGE試驗(yàn)證實(shí)，在污泥顆?；^程中厭氧氨氧化菌得到有效富集，反應(yīng)器內(nèi)總氮去除活性增加51.7倍。
　　 研究了營養(yǎng)因子和理化因素對厭氧氨氧化污泥顆?；挠绊?。獲得的厭氧氨氧

9、化顆粒污泥的最大氨氧化速率為6.08 mg/L.h，最大亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化速率為6.32mg/L.h。厭氧氨氧化菌混培物利用氨的Km值為130.63 mg/L，利用亞硝酸鹽的Km值為51.30 mg/L。氨自身的抑制常數(shù)為478.69 mg/L，實(shí)際取得最大厭氧氨氧化速率的氨濃度為109.50 mg/L。亞硝酸鹽對厭氧氨氧化的抑制常數(shù)為345.44mg/L。厭氧氨氧化的最適pH為7.61，最適溫度為30℃。
　　 4)采用系統(tǒng)稀釋和平

10、板劃線分離的方法，獲得了7株具有亞硝化活性的菌株，其中一株是放線菌，經(jīng)鑒定歸于鏈霉菌屬的比基尼鏈霉菌，因時間關(guān)系未試驗(yàn)該菌的厭氧氨氧化活性。選取N1菌株作為研究對象，研究了厭氧氨氧化活性。N1菌株有鞭毛，能夠運(yùn)動；菌體呈橢球形，大小為0.8～1.2×1.0～1.5μm；菌落呈白色，圓形，直徑較小(1 mm左右)。革蘭氏染色反應(yīng)為陰性。N1菌株的內(nèi)膜折疊成平囊狀，有規(guī)則地分布于細(xì)胞質(zhì)外圍，屬于典型的Nitrosomonas屬內(nèi)膜特征。從形

11、態(tài)、大小和內(nèi)膜排列、G+C％含量、16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，N1菌株屬于Nitrosomonas halophila。
　　 N1菌株是典型的亞硝化細(xì)菌，在好氧下該菌株的最大氨氧化速率為9.83mg/L.d，最適pH為8.47。在厭氧下該菌株具有厭氧氨氧化活性，最大厭氧氨氧化速率是0.77 mg/L.d，氨和亞硝酸鹽以1:1.21的比例轉(zhuǎn)化，但不能生長。
　　 5)從厭氧氨氧化富集培養(yǎng)物中分離獲得了3株

12、具有厭氧氨氧化活性的反硝化菌，編號為D1，D2和D3，以D3菌株的厭氧氨氧化活性最強(qiáng)。
　　 D3菌株為桿菌，0.4～0.6×1.4～1.8μm，單極生鞭毛。菌落乳白色，圓形，菌落油滴狀，直徑2-3 mm。革蘭氏染色反應(yīng)為陰性。D3菌株的形態(tài)觀察結(jié)果、生理生化試驗(yàn)結(jié)果、BitekGN系統(tǒng)測試結(jié)果、Biolog碳源利用微平板鑒定系統(tǒng)的鑒定結(jié)果、菌株G+C mol％含量測定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，一致將D3菌株歸入假單胞菌屬，門多薩

13、假單胞菌(Pseudomonas mendocina)。
　　 在普通細(xì)胞培養(yǎng)基上生長時D3菌株的比生長速率為0.342/h，代時為2.03h，最適生長pH為8.11，最適生長溫度為34.5℃；在反硝化培養(yǎng)基上生長時D3菌株的比生長速率為0.148/h，代時為4.69 h，最適生長pH為7.81，最適生長溫度為34.5℃。D3菌株具有明顯的反硝化活性，最大硝酸鹽還原速率為14.96mg/L.d。D3菌株具有明顯的厭氧氨氧化活性，

14、在厭氧下同時消耗氨氮和硝酸鹽，消耗的比值為1:1.91。
　　 研究了D3菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)與厭氧氨氧化活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與厭氧氨氧化活性密切相關(guān)，隨厭氧氨氧化活性的出現(xiàn)而出現(xiàn)，隨厭氧氨氧化活性的消失而消失。
　　 6)采用逐級稀釋和滾管法分離獲得了4株具有厭氧氨氧化活性的菌株，編號為P1，P2，P3和P4，選取厭氧氨氧化活性最強(qiáng)的P2菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　 P2菌株形態(tài)不規(guī)則，滾管上生長的菌落呈圓形，直徑