磷脂酶A1的非水相催化及固定化研究.pdf

1、大豆卵磷脂(PC)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)產(chǎn)品等行業(yè)，近年來對卵磷脂的酶法改性研究較多。本文利用磷脂酶在非水介質(zhì)中催化卵磷脂水解生成甘油磷酸膽堿(GPC)，對其反應(yīng)體系的構(gòu)建、產(chǎn)物初步分離純化及分析方法的建立、制備工藝的優(yōu)化、有機(jī)溶媒的回收、反應(yīng)機(jī)理及酶的固定化進(jìn)行了探索性研究。
　　論文首先以底物PC為表面活性劑，己醇為助表面活性劑，庚烷為油相，醋酸鹽緩沖液為水相構(gòu)建W/O型微乳體系，初步確定的微乳液的構(gòu)成為：PC：庚烷

2、：己醇：水相=1:6.3:0.9:0.5，其中PC為質(zhì)量單位(g)，其它為體積單位(mL)。在此反應(yīng)體系中以磷脂酶為催化劑做催化反應(yīng)，酸堿滴定法判斷反應(yīng)終點。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液經(jīng)初步的分離純化--萃取后，分別以TLC法和HPLC法對GPC粗品做定性和定量檢測，此時GPC產(chǎn)率為85％。
　　其次，對酶法制備GPC的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最適溫度40℃；最適pH5.0；Ca2+對產(chǎn)物的產(chǎn)量沒影響；補(bǔ)加底物前，酶與緩沖液的體積比為1:2；初始反

3、應(yīng)底物濃度為0.278g/mL，即此時初始反應(yīng)體系變?yōu)椋篜C：庚烷：己醇：水相=2:6.3：0.9:0.5；補(bǔ)加底物濃度為0.437g/mL；補(bǔ)加質(zhì)量為初始質(zhì)量的一半；補(bǔ)加底物的同時要補(bǔ)充適量水相緩沖液，緩沖液的量按PC：庚烷：己醇：水相=1:2:0.286：0.25計算；補(bǔ)加時間為反應(yīng)后1.5h；反應(yīng)總時間為6h；實行補(bǔ)加工藝后，GPC產(chǎn)率增長到96.5％。采用將反應(yīng)液先旋蒸后萃取的方法使反應(yīng)試劑與萃取劑分離，分別回收。其中萃取劑二氯

4、甲烷、甲醇/水可通過旋蒸回收，反應(yīng)試劑庚烷和己醇利用氣相色譜外標(biāo)定量法測出體積比，然后配成原比例7:1，重新用于下一批反應(yīng)。在磷脂酶催化水解PC制備GPC的過程中，通過TLC法證實了反應(yīng)過程中確有中間產(chǎn)物L(fēng)PC的生成，通過酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化為GPC。
　　論文最后對磷脂酶的固定化進(jìn)行了研究。通過比較戊二醛交聯(lián)法、吸附包埋法、吸附法三種方法制備的固定化酶催化制備GPC的研究，發(fā)現(xiàn)吸附法制備的固定化酶催化效果較好。然后研究了硅藻土、

5、陽離子交換樹脂001*7(732)、Seplite樹脂LX-1000EP、Seplite樹脂LX-1000NHF四種載體的吸附固定化效果。其中LX-1000NHF載體制備的固定化酶催化反應(yīng)時間稍短，產(chǎn)物產(chǎn)量較高。其固定化條件為：載體與酶量比為5:2(m/v)，吸附時間5h，吸附溫度為室溫；固定化酶與游離酶的Km值分別為0.705g/mL和0.184g/mL；以5g底物為例，固定化酶制備GPC的最適加酶量為3g，最適溫度60℃，最適水含量