微生物轉(zhuǎn)化法制備姜黃素衍生物的研究.pdf

1、姜黃素（Curcumin）為疏水性多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗HIV等多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性，但由于其水溶性低，生物半衰期短，穩(wěn)定性差等問(wèn)題，制約了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。對(duì)姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是解決上述問(wèn)題的有效方法之一。
　　本文針對(duì)微生物轉(zhuǎn)化法制備姜黃素衍生物進(jìn)行了優(yōu)良轉(zhuǎn)化菌株的篩選、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程的優(yōu)化等方面的研究。
　　首先，從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選得到一

2、株對(duì)姜黃素具有優(yōu)良轉(zhuǎn)化性能的紅球菌(Rhodococcus sp.)90-4。TLC法和HPLC法檢測(cè)表明，該菌株轉(zhuǎn)化姜黃素后得到兩個(gè)主要產(chǎn)物，其中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Ⅰ的Rf值為0.329，保留時(shí)間為26.4 min，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Ⅱ的Rf值為0.505，保留時(shí)間為29.9 min。利用硅膠柱層析法和制備薄層色譜法對(duì)紅球菌90-4的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分離純化，得到純度均大于95％的產(chǎn)物Ⅰ15.2 mg，產(chǎn)物Ⅱ10.1 mg。UV結(jié)果顯示，在200~500 n

3、m的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，兩種產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)均為280 nm。LC-MS結(jié)果顯示，產(chǎn)物Ⅰ的分子量為376，根據(jù)分子離子峰和碎片峰的分子量信息，初步推斷產(chǎn)物Ⅰ為八氫姜黃素；產(chǎn)物Ⅱ的分子量是374，根據(jù)分子離子峰和碎片峰的分子量信息，初步推斷產(chǎn)物Ⅱ?yàn)榱鶜浣S素。1H-NMR、13C-NMR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了推測(cè)結(jié)果。
　　其次，以菌體生物量和八氫姜黃素產(chǎn)率為優(yōu)化目標(biāo)，采用單因素法對(duì)紅球菌90-4的產(chǎn)酶條件和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳

4、培養(yǎng)基組成為：葡萄糖40 g/L，酵母膏20 g/L，Li2SO40.2 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O0.6 g/L，NaCl0.6 g/L；最佳轉(zhuǎn)化條件為：pH6.6的磷酸緩沖液，細(xì)胞濃度300 g/L，底物濃度100 mg/L，轉(zhuǎn)化36 h。通過(guò)優(yōu)化，菌體生物量（干重）達(dá)到5.84 g/L，八氫姜黃素產(chǎn)率由20.08%增加到59.89%，為優(yōu)化前的2.98倍。
　　最后，

5、以菌體生物量和六氫姜黃素產(chǎn)率為優(yōu)化目標(biāo)，采用單因素和正交優(yōu)化相結(jié)合的方法對(duì)紅球菌90-4的產(chǎn)酶條件和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基組成為：蛋白胨35 g/L，葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO43.0 g/L，MgSO4·7H2O0.6 g/L，NaCl0.6 g/L；最佳轉(zhuǎn)化條件為：pH6.6的磷酸緩沖液，細(xì)胞濃度200 g/L，底物濃度100 mg/L，轉(zhuǎn)化24 h。通過(guò)優(yōu)化，六氫姜黃素產(chǎn)率