白血病抑制因子LIF對(duì)抗霉毒A誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景：抗霉素A(Antimycin A，AMA)是從鏈霉菌屬中提取的A1和A3的混合物。研究表明，AMA能夠抑制線粒體呼吸鏈內(nèi)部的電子傳遞，使線粒體內(nèi)外膜質(zhì)子梯度降低，造成活性氧大量積累。在正常細(xì)胞內(nèi)，活性氧主要由線粒體呼吸鏈產(chǎn)生，線粒體呼吸鏈的紊亂將導(dǎo)致過(guò)量的活性氧釋放到胞漿中，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。
　　 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞一種程序性死亡，是誘導(dǎo)細(xì)胞自殺的過(guò)程，一些神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程與凋亡有關(guān)。由于過(guò)量的

2、活性氧與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因此AMA也常被用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)屬于白介素-6(IL-6)家族，許多組織和細(xì)胞(活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等)均可分泌一定量的LIF。研究表明，LIF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。JAK-STAT信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參

3、與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過(guò)程。IL-6家族細(xì)胞因子的作用均與JAK-STAT信號(hào)通路有關(guān)。
　　 PC12細(xì)胞取自大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NerveGrowth Factor，NGF)后，在形態(tài)和功能上向交感神經(jīng)元分化，常被當(dāng)做體外神經(jīng)元模型來(lái)作生理、病理及毒理等研究。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究LIF對(duì)AMA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的作用，探討在此過(guò)程中LIF引起PC12細(xì)

4、胞損傷的機(jī)制，從而為治療神經(jīng)退行性疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：用MTT(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide)檢測(cè)細(xì)胞活性，以確定AMA模型組和LIF實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞的存活數(shù)量；分別用Hoechst33342和annexin V-FITC/PI熒光標(biāo)記細(xì)胞，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀定性和定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用氯甲基二氯二氫熒光素二乙

5、酯(6-chloromethyl-2’，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，acetyl ester，M-H2DCFDA)標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度來(lái)檢側(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。用超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，進(jìn)一步確定LIF和ROS在此過(guò)程中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.模型組AMA能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，低劑量的LIF(0.5-1

6、 ng/ml)可使減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，高劑量的LIF則增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量；
　　 2.AMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS緊密相關(guān)，低劑量的LIF(0.5-1 ng/ml)能夠清除PC12細(xì)胞內(nèi)的ROS以提高細(xì)胞的存活，高劑量的LIF(25-50 ng/ml)則伴隨有ROS的增多；
　　 3.AMA能夠誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生紊亂，降低SOD的活性，而低劑量的LIF(0.5-1 ng/ml)加入后SOD的活性增加，劑量達(dá)到25 n