青蒿二烯功能模塊與酵母底盤的適配性研究.pdf

1、作為抗瘧疾藥物青蒿素的關鍵前體,青蒿二烯的異源合成近年來受到廣泛關注。盡管青蒿二烯的異源合成已經(jīng)達到了較高水平,構建功能釀酒酵母細胞合成青蒿二烯的關鍵是使外源功能模塊和底盤細胞適配,外源模塊與底盤細胞適配性的提高可以為產(chǎn)量的進一步提高提供可能。
　　本研究首先使用著絲粒載體和附加型載體構建兩種青蒿二烯功能模塊,在過表達甲羥戊酸途徑中關鍵基因(截短的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因tHMGR、法尼基焦磷酸合酶基因ERG20)

2、的兩種酵母底盤中進行適配,得到適配性較好的功能酵母細胞,其產(chǎn)量為11.2mg/L,選用適配性最好的附加型載體與改造的W303a底盤細胞進行后續(xù)研究,進一步提高外源模塊與底盤間的適配性。
　　隨后將青蒿二烯合酶基因ADS與ERG20進行融合構建融合蛋白功能模塊,并采用不同強度的啟動子(TDH1p、TDH3p、TEF1p、PGK1p)對融合蛋白功能模塊進行調控,其中PGK1p所調控的融合蛋白(ERG20-ADS)功能模塊與底盤間的適配

3、性最好,產(chǎn)量相較第一部分提高了5.4倍,達到71.8mg/L。
　　最后,以20種基于BY4742的基因缺失酵母為底盤細胞,探究這些基因的敲除對于青蒿二烯合成的影響。結果表明,與野生型酵母BY4742相比,16種基因缺失酵母中青蒿二烯的產(chǎn)量體現(xiàn)出不同程度的提高或降低,證明這些基因的敲除對青蒿二烯的合成存在間接的作用。
　　本研究通過對外源模塊的載體類型、啟動子強度、表達方式進行優(yōu)化及與不同遺傳背景的酵母底盤間的適配性研究,逐