基于光子晶體編碼微球的農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、我國是農(nóng)藥生產(chǎn)與消費大國，隨著農(nóng)藥的大量和不合理地使用，農(nóng)藥殘留對人類健康、生態(tài)環(huán)境以及對外貿(mào)易造成的負(fù)面影響漸漸顯露出來，農(nóng)藥殘留通過各種可能的途徑危及食品安全、人畜安全以及生態(tài)環(huán)境等問題備受關(guān)注。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的農(nóng)藥通過沉降、地表徑流等途徑進(jìn)入環(huán)境，引起水資源污染、水生態(tài)系統(tǒng)破壞、食品安全等一系列問題。因此，為了保護(hù)人們的健康以及控制農(nóng)藥對環(huán)境的污染，發(fā)展靈敏、快速以及成本低的農(nóng)藥定量檢測技術(shù)是非常必要的。經(jīng)典的農(nóng)藥殘留儀器檢測

2、方法包括HPLC、GC-MS、LC-MS等，雖然這些方法靈敏、可靠，但是存在儀器昂貴、需要專業(yè)的技術(shù)人員操作、樣品前處理復(fù)雜、耗時長等缺點，而且檢測過程中大量有機(jī)溶劑的使用可能引起環(huán)境污染，因此其應(yīng)用受到了一定的限制?？焖贆z測技術(shù)是監(jiān)控農(nóng)藥殘留的有效手段，基于免疫分析的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測費用低等優(yōu)點，是當(dāng)前國內(nèi)外農(nóng)藥殘留快速檢測的研究熱點，可以實現(xiàn)對農(nóng)藥殘留的快速檢測。但是，國內(nèi)外現(xiàn)有的研究主要

3、集中于針對單一農(nóng)藥建立特異性的免疫分析方法，而實際樣品中普遍同時存在多種農(nóng)藥，建立同時檢測多種農(nóng)藥的檢測方法是擬解決的關(guān)鍵問題。與單一分析物檢測方法相比，以編碼微球作為載體的液相芯片技術(shù)具有高通量、檢測時間短、樣品用量少、檢測效率高、成本低以及可以進(jìn)行多種分析物的同時檢測等優(yōu)點。因此，本研究將液相芯片技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域，以膠體光子晶體微球和光子晶體水凝膠復(fù)合微球作為編碼微載體，以有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為分析對象，建立了基

4、于膠體光子晶體微球同時檢測殺螟硫磷和甲基毒死蜱的液相芯片技術(shù)和基于光子晶體水凝膠復(fù)合微球同時檢測五種有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥（殺螟硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲萘威和速滅威）的液相芯片技術(shù)，為相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容和結(jié)果:
　　(1)膠體光子晶體微球的制備
　　利用協(xié)流式玻璃微流控平臺，使用不同粒徑的二氧化硅納米粒子制備具有不同反射光譜的膠體光子晶體微球，為后續(xù)的農(nóng)藥多殘留液相芯片檢測技術(shù)提供編碼載

5、體。
　　(2)基于膠體光子晶體微球同時檢測殺螟硫磷和甲基毒死蜱的液相芯片技術(shù)
　　通過將農(nóng)藥單克隆抗體偶聯(lián)于膠體光子晶體微球表面作為檢測探針，加入待檢的游離農(nóng)藥和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的農(nóng)藥抗原，采用直接競爭法，在液相反應(yīng)體系中游離的農(nóng)藥和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的農(nóng)藥抗原共同競爭微球上各自特異性的農(nóng)藥單克隆抗體，待測農(nóng)藥含量越少，結(jié)合到微球表面抗體上的農(nóng)藥抗原越多，檢測時的熒光強(qiáng)度越高;反之，待測農(nóng)藥含量越多，結(jié)合到微球表面抗體上

6、的農(nóng)藥抗原越少，檢測時的熒光強(qiáng)度越低。根據(jù)熒光強(qiáng)度與待檢農(nóng)藥的濃度呈一定的相關(guān)性，因此可定量檢測農(nóng)藥。經(jīng)過條件優(yōu)化后，繪制了同時檢測甲基毒死蜱和殺螟硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性檢測范圍分別為0.40～735.37 ng/mL和0.25～1024ng/mL，最低檢測限分別為0.25 ng/mL和0.40 ng/mL。以毒死蜱、對硫磷、甲基對硫磷、三唑磷、殺撲磷、溴硫磷、三氯吡啶酚、倍硫磷、對氧磷、氯硫磷進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗，交叉反應(yīng)率均小于5％，該方

7、法對各種干擾物無明顯交叉反應(yīng)，特異性良好。添加殺螟硫磷和甲基毒死蜱于空白的葡萄、萵筍以及白菜樣品中，平均添加回收率范圍分別為81.6％～92.2％和82.4％～97.3％。實驗結(jié)果表明，該方法對殺螟硫磷和甲基毒死蜱的檢測具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、線性范圍寬和檢測限低等優(yōu)點，可以為農(nóng)藥殘留高通量分析提供了一種快速有效的實用分析方法。
　　(3)基于光子晶體水凝膠復(fù)合微球同時檢測五種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的液相芯片技術(shù)

8、>　　以膠體光子晶體微球為基礎(chǔ)，制備了五種不同反射光譜的光子晶體水凝膠復(fù)合微球作為液相芯片的編碼微載體。以五種應(yīng)用廣泛的有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為目標(biāo)分析物，將抗原-抗體免疫反應(yīng)與生物素-親和素放大體系相結(jié)合應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測，實現(xiàn)了對五種農(nóng)藥殘留同時檢測的目標(biāo)?；陂g接競爭免疫反應(yīng)來構(gòu)建農(nóng)藥多殘留檢測方法，偶聯(lián)在微球上的農(nóng)藥抗原與目標(biāo)農(nóng)藥競爭結(jié)合農(nóng)藥單克隆抗體，由于目標(biāo)農(nóng)藥可以抑制大分子農(nóng)藥抗原與相應(yīng)農(nóng)藥抗體的結(jié)合，當(dāng)樣品中農(nóng)

9、藥濃度增加時，由于抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，溶液中的抗原抗體免疫復(fù)合物增加，而結(jié)合到微球表面的抗體減少，形成的免疫復(fù)合物相應(yīng)減少，因此檢測時，熒光強(qiáng)度降低。根據(jù)熒光強(qiáng)度與待檢農(nóng)藥的量成一定的相關(guān)性，可以定量檢測農(nóng)藥。通過一系列的優(yōu)化和篩選實驗條件（抗原、抗體加入量、反應(yīng)時間等），進(jìn)一步的提高了液相芯片檢測技術(shù)的靈敏度以及穩(wěn)定性。該方法檢測殺螟硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲萘威和速滅威的最低檢測限分別為0.02ng/mL、0.012 ng/

10、mL、0.04 ng/mL、0.05 ng/mL和0.10 ng/mL，線性檢測范圍分別為0.02～1562.5 ng/mL、0.012～937.5 ng/mL、0.04～1250 ng/mL、0.05～819.2 ng/mL以及0.10～218.7 ng/mL，檢測五種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)(R2)均大于0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好。選擇毒死蜱、三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷、殺撲磷、溴硫磷、滅多威、蟲螨威、殘殺威、仲丁威以及異丙威進(jìn)行交叉

11、反應(yīng)實驗，不同農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均很低（＜5％)，該檢測方法對農(nóng)藥干擾物無明顯交叉反應(yīng)，特異性良好。
　　本方法在蘋果、萵筍、白菜、黃瓜以及西紅柿中的添加回收率范圍分別為88.9～106.2％、82.6～106.3％、85.4～105.5％、88.7～104.3％和85.6～103.5％，在環(huán)境水樣中的添加回收率范圍為83.3％～102.2％，LC-MS/MS方法在蘋果、萵筍、白菜、黃瓜以及西紅柿中添加回收率分別為85.9％～104

12、.3％、88.4％～105.6％、86.7％～103.6％,84.6％～102.7和85.3％～105.6％，在環(huán)境水樣中的添加回收率范圍為85.6％～95.3％，這兩種方法的添加回收實驗結(jié)果基本吻合。通過方法比對實驗，進(jìn)一步確定了液相芯片檢測方法的準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)的LC-MS/MS方法相比，基于光子晶體水凝膠微球的液相芯片檢測方法簡便、快速、結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠滿足農(nóng)產(chǎn)品以及環(huán)境水樣中痕量農(nóng)藥的檢測要求，可以作為一種簡便、快捷、高通量的檢