維醫(yī)異常膽液質(zhì)證與潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的組學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　本研究論文主要選擇維醫(yī)異常膽液質(zhì)證模型大鼠與TNBS-乙醇灌腸液誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠為研究對象，通過分析大鼠一般體征、下丘腦及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化;通過代謝組學(xué)分析下丘腦、結(jié)腸代謝組份差異;通過RNA-Seq測序技術(shù)研究下丘腦、結(jié)腸轉(zhuǎn)錄譜差異;通過研究甲狀腺激素異常對異常膽液質(zhì)證與UC大鼠代謝紊亂產(chǎn)生的作用，綜合分析異常膽液質(zhì)證形成及其誘發(fā)UC的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1）采用干熱飼養(yǎng)環(huán)境、干熱

2、屬性飼料（黑胡椒、干姜、西紅花）、夾尾、噪音等多因素復(fù)合刺激，建立異常膽液質(zhì)證載體動物模型。通過TNBS乙醇液灌腸復(fù)制大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，觀察大鼠生物表型改變及組織形態(tài)學(xué)改變;
　　2）利用核磁共振技術(shù)檢測多因素復(fù)合誘導(dǎo)的異常膽液質(zhì)證、UC大鼠模型中下丘腦和結(jié)腸代謝產(chǎn)物的變化;
　　3）應(yīng)用RNA-seq全面分析異常膽液質(zhì)證和UC大鼠下丘腦和結(jié)腸組織的轉(zhuǎn)錄本，篩選出差異表達基因。第二，應(yīng)用GO方法進行差異基因的功能聚類，應(yīng)

3、用KEGG信號通路富集差異表達基因相關(guān)的信號通路。第三，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析差異表達基因之間的相互作用，篩選出重要的差異表達基因。第四，應(yīng)用實時熒光定量PCR方法驗證差異基因的表達水平;
　　4）檢測血清中甲狀腺功能7項指標(biāo)及血清糖脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)，通過相關(guān)性分析，分析甲狀腺激素水平與異常膽液質(zhì)證及潰瘍性結(jié)腸炎形成中對代謝的影響。同時通過血清代謝組學(xué)的結(jié)果繪制代謝的整體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。
　　結(jié)果:
　　1）通過多

4、因素復(fù)合造模方法成功模擬出了符合人體異常膽液質(zhì)證臨床表現(xiàn)的證候模型以及成功復(fù)制了TNBS-UC模型。肉眼觀察異常膽液質(zhì)證結(jié)腸組織出現(xiàn)輕微充血，HE染色后鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)異常膽液質(zhì)證組出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤。異常膽液質(zhì)證組下丘腦鏡下出現(xiàn)腦血管擴張充血，血管周圍間隙增寬，部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變圓。UC組結(jié)腸肉眼可見腸壁壞死充血水腫現(xiàn)象，部分深大潰瘍表面有黑褐色膜狀物附著，周邊腸黏膜充血、水腫明顯，病變部位腸壁明顯增厚，管壁僵硬。HE染色后鏡下可見黏膜

5、上皮細(xì)胞變性壞死，黏膜固有層，黏膜下層大量中性粒細(xì)胞浸潤伴纖維素滲出及片狀出血，符合急性炎癥的組織病理學(xué)改變，與人類UC急性期改變相似。UC模型組下丘腦鏡下出現(xiàn)腦血管擴張充血，血管周圍間隙增寬，部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變圓;
　　2）下丘腦代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示異常膽液質(zhì)證組顯著性高峰度代謝物為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙醇、γ-氨基丁酸、N-乙酰天冬氨酸、膽堿和肌醇，顯著性低峰度代謝物為谷氨酸和牛磺酸。UC組具有顯著性高峰度代謝物為:乙醇

6、，γ-氨基丁酸，N-乙酰天冬氨酸，乳酸，苯丙氨酸。通過對樣本間進行RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)異常膽液質(zhì)證大鼠在下丘腦中大量的通路與神經(jīng)信號通路相關(guān)，如“Neuroactive ligand-receptor interaction”，“Cocaine addiction”，“Amphetamine addiction”，“Serotonergic synapse”，“dopaminergic synapse”等。UC組在丘腦組織中上調(diào)表達

7、的基因富集到“Adipocytokine signaling pathway”、“Calciumsignaling pathway”、“Tyrosine metabolism”、“Cytokine-cytokine receptor interaction”、“PI3K-Akt signaling pathway”等通路。異常膽液質(zhì)證組和UC組差異基因共表達分析，發(fā)現(xiàn)2條和甲狀腺激素應(yīng)答相關(guān)通路，分別是“Thyroid hormone

8、synthesis”、“Autoimmune thyroid disease”，差異表達基因為Cga，Tshb。結(jié)合GO-蛋白網(wǎng)絡(luò)圖和基因通路網(wǎng)絡(luò)圖，找到四個共同上調(diào)基因，分別是Pmch、Cga、Tshb和Hcrt;
　　3）結(jié)腸代謝組學(xué)分析顯示異常膽液質(zhì)證組具有顯著性高峰度代謝物為:3-羥基丁酸，乳酸，琥珀酸，ATP/ADP。異常膽液質(zhì)證組具有顯著性低峰度代謝物為:GSH，甘油磷酸膽堿，肌醇。UC組的差異代謝物結(jié)果顯示，和正常組

9、對比，UC組結(jié)腸具有顯著性高峰度代謝物為:丁酸，丙酸，乙醇，3-羥基丁酸，乙酸，琥珀酸，甲胺，二甲胺，丙二酸，葡萄糖，糖原。UC組具有顯著性低峰度代謝物為:丙氨酸，谷氨酰胺，谷胱甘肽，甘油磷酸膽堿，肌醇，磷酸肌酸，?；撬幔◆?。結(jié)腸組織獲得差異表達基因通過GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)在異常膽液質(zhì)證組結(jié)腸出現(xiàn)了炎癥、免疫相關(guān)通路基因表達下調(diào)，而UC組炎癥、免疫相關(guān)通路基因表達上調(diào)的現(xiàn)象。將異常膽液質(zhì)證與UC組取并集，運用WGCNA進行分析，選

10、擇在正常組和異常膽液質(zhì)證組低表達，UC組高表達的module進行KEGG通路分析，得到的大部分功能通路與免疫相關(guān)，如“Cytokine-cytokine receptor interaction”,“TNF signaling pathway”,“PI3K-Aktsignaling pathway”，“NF-kappa B signaling pathway”等信號通路，同時也發(fā)現(xiàn)2條甲狀腺激素相關(guān)的通路，篩選甲狀腺激素主要信號通路，通

11、過基因間的相互作用網(wǎng)路關(guān)系圖，發(fā)現(xiàn)Tnf是其中的核心分子。通過Thrsp基因做共表達分析，發(fā)現(xiàn)糖異生關(guān)鍵酶PCK1、FBP的下調(diào)和GK上調(diào)。同時糖酵解途徑中PKLR和GPD1出現(xiàn)下調(diào)，脂肪酸β-氧化中脂酰CoA脫氫酶(Acadsb)基因表達卻上調(diào)，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸-半胱氨酸連接酶均下調(diào);
　　4）血清中T3、T4、FT3、FT4水平在異常膽液質(zhì)證組和UC組均降低，異常膽液質(zhì)證組雖然降低，但仍然處在正常范圍內(nèi)，UC組明顯低于

12、正常水平。血糖、果糖胺、甘油三酯、載脂蛋白B在UC組中顯著升高，高密度脂蛋白顯著降低，(P＜0.05)。甲狀腺激素與葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇存在負(fù)相關(guān)，與高密度膽固醇正相關(guān)。異常膽液質(zhì)證組最終確定大鼠血清中有13種的差異性代謝成分，其中異常膽液質(zhì)證組中顯著升高的代謝物為:異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、丙酮酸、肉堿、β-羥丁酸、乳酸、肌酸，顯著降低的代謝物為:VLDL、瓜氨酸、酪氨酸。和正常組比較后，UC組中共找到13種差異代謝物，

13、在UC組中顯著升高的代謝物為:LDL、乳酸、肌酸，UC組中顯著降低的代謝物為:亮氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、丙氨酸、肉堿、檸檬酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、甲基組氨酸。
　　結(jié)論:
　　1）通過干熱屬性飼料，干熱環(huán)境喂養(yǎng)，夾尾、噪音、慢性足底電刺激多因素復(fù)合方法造模，大鼠出現(xiàn)了出現(xiàn)情緒易激動、喜打斗、舌苔發(fā)黃、尿色黃、糞便于硬、體重減輕、飲水、飲食量增加的現(xiàn)象。成功模擬出了符合人體異常膽液質(zhì)證臨床表現(xiàn)的證候模型。成功復(fù)制TN

14、BS乙醇液灌腸誘導(dǎo)大鼠潰瘍性炎癥的發(fā)生。模型中結(jié)腸組織出現(xiàn)了與人類UC急性期相似的病理改變;
　　2）下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常，膜穩(wěn)定性破壞及能量代謝異常是異常膽液質(zhì)證組與UC組中的共同表現(xiàn)。TSH編碼基因Cga和Tshb表達上調(diào)，可能是異常膽液質(zhì)證組和UC組下丘腦對刺激的應(yīng)答反應(yīng)，在異常膽液質(zhì)證和UC形成過成中都起到非常關(guān)鍵的作用，推測在異常膽液質(zhì)證誘發(fā)UC過程中發(fā)揮重要作用;
　　3）結(jié)腸組織出現(xiàn)的能量代謝失衡、氧化抗氧化

15、體系平衡紊亂、細(xì)胞膜穩(wěn)定性破壞是導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的主要因素，同時也是異常膽液質(zhì)證誘發(fā)UC的主要原因。TNF-α一方面通過抑制GSH活性使結(jié)腸細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，另一方面做為促炎細(xì)胞因子，通過激活和放大的雙重作用，以DAG-PKC-NF-κB信號傳導(dǎo)途徑激活而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，在UC形成中起重要作用;
　　4）血清甲狀腺激素含量降低是異常膽液質(zhì)證組與UC組發(fā)生的共同物質(zhì)基礎(chǔ)。異常膽液質(zhì)證與UC形成過程中，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互作