生物活性小分子電化學(xué)傳感界面的構(gòu)建及其細(xì)胞釋放的實(shí)時(shí)檢測.pdf

1、細(xì)胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單元，其中存在一些具有特殊生理功能的活性小分子物質(zhì)，如活性氮分子(RNS)和活性氧分子(ROS)等。它們是一類含氮或含氧自由基或分子，對(duì)于脂類、蛋白質(zhì)以及核酸分子均有較高反應(yīng)活性?；诩?xì)胞內(nèi)RNS和ROS的濃度，它們既可以充當(dāng)“朋友”亦可以是“敵人”，其濃度處于正常值時(shí)，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、控制細(xì)胞的增殖、分化與凋亡、促進(jìn)多種因子細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的啟動(dòng)；而當(dāng)平衡打破，其濃度升高時(shí)，則會(huì)引起氧化應(yīng)激、導(dǎo)致細(xì)

2、胞膜脂質(zhì)過氧化、引起DNA的氧化損傷、介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性等，進(jìn)一步造成細(xì)胞癌變和死亡、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、甚至心血管疾病等。鑒于此，原位實(shí)時(shí)定量檢測活細(xì)胞釋放RNS和ROS，不僅能幫助我們從分子水平理解它們介導(dǎo)生理過程，而且有助于我們揭示其引發(fā)相關(guān)疾病的機(jī)制，從而進(jìn)行疾病早期檢測、預(yù)防及選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒?。然而，RNS和ROS的實(shí)時(shí)靈敏檢測極具挑戰(zhàn)性，其釋放的量很少且半衰期短、活性高、易與生物環(huán)境中其他分子發(fā)生反應(yīng)。因此，構(gòu)建有效、靈敏

3、的檢測平臺(tái)及生物相容性良好的細(xì)胞生長平臺(tái)是RNS和ROS原位檢測的關(guān)鍵。電化學(xué)方法操作簡便、特異性強(qiáng)、響應(yīng)快、靈敏度高且成本低，因而成為細(xì)胞釋放活性小分子檢測的常用技術(shù)手段。碳材料如碳納米管、石墨烯等被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)平臺(tái)的建設(shè)及細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。
　　本論文設(shè)計(jì)并合成了功能納米材料協(xié)同催化的仿生酶，提高了檢測穩(wěn)定性和選擇性，并構(gòu)筑了具有生物兼容性和特異催化活性的納米界面，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度活細(xì)胞釋放RNS和ROS小分子的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢

4、測，并深入探討了其催化機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了活細(xì)胞直接生長的2D及3D自支撐傳感膜，并系統(tǒng)研究了該傳感膜的細(xì)胞粘附及電化學(xué)性能，結(jié)果表明將細(xì)胞直接生長在傳感膜上可以大大提高檢測的靈敏度。主要內(nèi)容及結(jié)果歸納如下：
　　1. NO是眾多癌細(xì)胞病變過程中釋放的一種信號(hào)傳導(dǎo)分子。然而，由于NO極易擴(kuò)散、濃度低、壽命短，實(shí)現(xiàn) NO的實(shí)時(shí)檢測仍是極大的挑戰(zhàn)。本工作通過水熱法合成了形貌可控的還原氧化石墨烯-二氧化鈰納米復(fù)合物(rGO-C

5、eO2)，并用它來構(gòu)建高靈敏的NO實(shí)時(shí)檢測傳感器。rGO-CeO2納米復(fù)合物中 CeO2的晶體形貌對(duì)rGO-CeO2傳感器的性能有重要影響。其中，六邊形的CeO2納米晶體催化性能最佳，達(dá)到了最高的靈敏度(1676.06 mA/(cm2·mol/L))，較寬的線性范圍(18.0 nmol/L到5.6μmol/L)及低的檢測限(9.6 nmol/L)。這一最優(yōu)性能主要?dú)w功于特殊形貌的CeO2良好的催化性能及rGO優(yōu)良的導(dǎo)電性和高的比表面積。

6、本工作展示了一個(gè)通用的方法通過有效調(diào)控復(fù)合物中單組分的優(yōu)勢(shì)來合成具有超強(qiáng)協(xié)同作用的傳感平臺(tái)，同時(shí)也為快速實(shí)時(shí)檢測活細(xì)胞釋放NO提供了極大的可能性。
　　2. O2-是細(xì)胞釋放的一種ROS小分子，正常情況下對(duì)細(xì)胞的多種生命活動(dòng)起著重要的介導(dǎo)作用，但是當(dāng)其含量超過正常水平時(shí)，會(huì)打破體內(nèi)氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而損壞細(xì)胞、引發(fā)病變，因此，實(shí)時(shí)定量檢測細(xì)胞釋放的O2-對(duì)于疾病的診斷及預(yù)防非常重要。本工作中，采用DNA誘導(dǎo)合成的磷酸錳

7、梭狀材料(DNA@Mn3(PO4)2)作為O2-生物模擬酶功能化修飾氧化石墨烯(GO)。該材料制備的特異性生物模擬酶傳感器表現(xiàn)出較高的靈敏度(1556.97 mA/(cm2·mol/L))、較寬的檢測范圍(6.5 nmol/L到8.85μmol/L)和極低的檢測限(2.1 nmol/L)。此外， DNA@Mn3(PO4)2/GO傳感器實(shí)現(xiàn)了原位實(shí)時(shí)檢測藥物刺激下人類皮膚癌細(xì)胞和正常細(xì)胞釋放的O2-，表現(xiàn)出良好的實(shí)時(shí)定量檢測性能。由實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果可得，癌細(xì)胞釋放的O2-量為正常細(xì)胞的5倍(平均值)。
　　3.原位實(shí)時(shí)檢測ROS對(duì)于研究各種基礎(chǔ)的細(xì)胞生理過程極其重要，但是目前報(bào)道的工作大多檢測的是生長在培養(yǎng)基中細(xì)胞釋放的ROS，其半衰期短、濃度低、活性高，造成測試的靈敏度和選擇性都受到極大的限制。本工作中，我們提出了一種新的方法將活細(xì)胞直接生長在 DNA/Mn3(PO4)2修飾的垂直生長碳納米管(VACNT)陣列上來構(gòu)建柔性支撐雜化膜，其中DNA/Mn3(PO4)作為一種

9、高效的O2-仿生歧化酶，表現(xiàn)出很高的電催化活性；VACNT具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物相容性，提供了快速電子轉(zhuǎn)移載體和細(xì)胞生長平臺(tái)，此外細(xì)胞直接生長在傳感膜表面大大縮短了檢測底物與活性位點(diǎn)之間的擴(kuò)散距離，從而實(shí)現(xiàn)了高靈敏實(shí)時(shí)檢測癌細(xì)胞在藥物刺激下釋放的O2-。與檢測培養(yǎng)基中細(xì)胞釋放O2-相比，檢測靈敏度增加了6倍多，證明活細(xì)胞分泌的O2-沒有經(jīng)過擴(kuò)散過程或經(jīng)過很短的擴(kuò)散距離，直接被生物膜捕獲并催化。這一設(shè)計(jì)縮短了細(xì)胞釋放的檢測目標(biāo)物與傳感器之

10、間的距離，避免了在此擴(kuò)散過程中，大部分目標(biāo)物由于活性高、壽命短而衰減的可能性，大大提高了傳感器的靈敏度。
　　4.眾所周知，細(xì)胞在生物體內(nèi)的實(shí)時(shí)生長環(huán)境是三維(3D)的，為了研究人類的生理活動(dòng)機(jī)理，我們必須在體外培養(yǎng)細(xì)胞，要想得到更準(zhǔn)確的研究數(shù)據(jù)，創(chuàng)造體外3D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境極其重要。然而，現(xiàn)在報(bào)道的大部分工作均是基于2D平臺(tái)。本工作中，我們創(chuàng)造了一個(gè)3D細(xì)胞貼附/生長環(huán)境，首先通過化學(xué)氣相沉積法制備3D泡沫石墨烯(GF)，然后采用綠

11、色、簡易的基底增強(qiáng)-化學(xué)沉積法在GF上修飾Pt納米顆粒。該P(yáng)t@GF復(fù)合物表現(xiàn)出良好的多功能性，其中3D大孔GF表現(xiàn)出了擬人體實(shí)時(shí)生物環(huán)境，為細(xì)胞的生長提供了良好的貼附/生長支架以利于后續(xù)細(xì)胞釋放O2-的高靈敏實(shí)時(shí)檢測，此外，Pt納米顆粒對(duì)O2-表現(xiàn)出了超強(qiáng)的電催化活性。熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡的觀察結(jié)果表明，細(xì)胞在3D Pt@GF復(fù)合物上的生長狀態(tài)、表達(dá)、貼附及代謝活動(dòng)相較其在2D Pt@石墨烯片(Pt@GS)復(fù)合物上，均表現(xiàn)出更優(yōu)